Los dominios PDZ de EBP50 - La interacción de PIP5KIβ con proteínas con dominios PDZ

1.3. La interacción de PIP5KIβ con proteínas con dominios PDZ

1.3.3. Los dominios PDZ de EBP50

Las proteínas de la familia “Na+_/H+_{exchanger regulatory factor” NHERF (Minkoff et} al., 1999; Weinman et al., 2000) desempeñan un papel central en el ensamblaje de complejos macromoleculares de señalización, así como la localización en la membrana y el reciclaje de receptores, canales iónicos y proteínas de adhesión en múltiples tejidos, mediante la interacción de sus dominios PDZ con la región citoplasmática de estas proteínas (Donowitz et al., 2005; Lamprecht and Seidler, 2006; Shenolikar et al., 2004; Thelin et al., 2005). NHERF1 se identificó inicialmente en tejido renal de conejo como un cofactor en la inhibición del intercambiador de Na+_/H+_{, en el borde en cepillo del túbulo proximal de las nefronas, (Weinman} et al., 1993; Weinman et al., 1995). El ortólogo humano de NHERF1 se identificó posteriormente con el nombre de “Ezrin-Radixin-Moesin-Binding-Phosphoprotein-50” (EBP50), una proteína que se une a la región C-terminal de las proteínas transmembranas mediante sus dominios PDZ y al citoesqueleto de actina en la región cortical a través de su dominio C-terminal (Reczek et al., 1997).

EBP50 es una proteína de 358 aa y consta de dos dominios globulares PDZ1 (aa 11-97) y PDZ2 (aa 150-240), que interaccionan con las regiones citoplasmáticas de receptores transmembrana y canales iónicos (Ardura and Friedman, 2011; Cheng et al., 2009; Cushing et al., 2008; Mahon et al., 2002), y un dominio C-terminal (aa 329-356) que interacciona con el dominio FERM de las proteínas ERM (Finnerty et al., 2004; Terawaki et al., 2006).

Los dominios PDZ1 y PDZ2 de EBP50 presentan una elevada similitud a nivel de secuencia, sin embargo existen diferencias en cuanto a los ligandos y la afinidad con que lo hacen (Cheng et al., 2009; Cushing et al., 2008; Li et al., 2007; Mahon and Segre, 2004). La mayoría de los ligandos de EBP50 interaccionan con el PDZ1 (Ardura and Friedman, 2011). Algunos de ellos interaccionan también con el PDZ2 aunque en general este dominio se une a un número más reducido de ligandos (Short et al., 1998; Voltz et al., 2001). Algunos receptores, como el Regulador de la Conductancia Transmembrana en la Fibrosis Quística (CFTR), la Acuaporina 9 (AQP9) y el Receptor de la Hormona Paratiroidea (PTHR), interaccionan con ambos dominios PDZ de EBP50, pero tienen una mayor afinidad por el PDZ1 (Mahon et al., 2002; Pietrement et al., 2008; Wheeler et al., 2008) (Ardura and Friedman, 2011; Hall et al., 1998a; Short et al., 1998). Sin embargo, el receptor de quimioquinas CXCR2 y la fosfolipasa-C- β2 (PLC-β2) interaccionan preferentemente con el PDZ2, respectivamente (Sun and Mierke, 2005; Wu et al., 2012). Estos resultados sugieren que los pequeños cambios en la secuencia de ambos dominios PDZ son suficientes para determinar la afinidad y especificidad de la interacción.

EBP50 puede adoptar una conformación cerrada en la cual los últimos 4 aa de su C- terminal (FSNL), que constituyen un motivo de unión a dominios PDZ, interaccionan con el PDZ2 de la propia proteína (Bhattacharya et al., 2010; Cheng et al., 2009). Esta conformación

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puede cambiar mediante la liberación del C-terminal, como consecuencia de su interacción con el dominio FERM de proteínas ERM (Bhattacharya et al., 2010; Cheng et al., 2009; Finnerty et al., 2004; Terawaki et al., 2006) ó mediante la fosforilación de la S162 del PDZ2 por la proteína quinasa C (PKC) (Li et al., 2007).

1.3.3.1 Estructura cristalográfica del dominio PDZ1 de EBP50.

Uno de los objetivos de esta tesis es caracterizar estructuralmente la interacción del dominio C-terminal de PIP5KIβ con el PDZ1 de EBP50. La estructura de EBP50 no ha sido resuelta sin embargo se ha determinado la estructura cristalográfica del dominio PDZ1 (Karthikeyan et al., 2001a), del PDZ2 (PDB: 2JXO), el dominio C-terminal en complejo con el dominio FERM de Ezrina (Finnerty et al., 2004; Terawaki et al., 2006), así como de ambos dominios PDZ en interacción con algunos de sus ligandos (Holcomb et al., 2014; Karthikeyan et al., 2001b, 2002; Lu et al., 2013). La estructura de los PDZ de EBP50 es muy similar a la descrita para la mayoría de estos dominios y consta de un sándwich de dos láminas β flanqueado por dos hélices α (Fig. 4A y B). Debido a que los últimos 4 aa del C-terminal del PDZ1 constituyen una secuencia de unión a dominios PDZ, en la estructura del PDZ1 se forma un dímero entre el C-terminal de una molécula y el bolsillo de unión a péptidos de otra molécula vecina (Fig. 4A). En el caso del PDZ2 (Fig. 4B) no se forman dímeros de este tipo, pues los aminoácidos C-terminales de este dominio (DEFFK) no constituyen un motivo de unión a PDZ.

Introducción

Figura 4. La estructura de los PDZ de EBP50 es muy similar a la descrita para otros dominios PDZ. Representaciones tipo “cartoon” de (A) el monómero y los homodímeros del dominio PDZ1 de EBP50 y (B) el PDZ2 de EBP50. (C) El C-terminal del PDZ1 se inserta en el bolsillo de unión a péptidos de manera perpendicular a la hebra β2 mediante las interacciones de la L0 con los residuos del bolsillo hidrofóbico y el E(-2) con la H72. El péptido se muestra en diagrama de barras con los carbonos en negro, los nitrógenos en azul y los oxígenos en rojo. Se muestra además el mapa de densidades electrónicas (derecha) y la interacción ampliada entre el E(-2) y la H72. (A y C adaptados de (Karthikeyan et al., 2001a).

La estructura del PDZ1 reveló además que el péptido C-terminal (DEQL) se inserta en el bolsillo de unión de manera perpendicular a la hebra β2 y no se produce el fenómeno de “β-sheet augmentation” (Fig. 4A y C). Esto es posible ya que el grupo carboxilato del E(-2) forma un puente de hidrógeno con uno de los nitrógenos en la cadena lateral de la H72 (Karthikeyan et al., 2001a) (Fig. 4C) y la larga cadena lateral del E(-2) aleja el resto del péptido (DEQL) del bolsillo de unión, impidiendo la interacción del resto de los residuos con la hebra β2.

El arreglo dimérico intermolecular que tiene lugar entre los dominios PDZ1 de EBP50 constituyen una herramienta muy útil en el estudio estructural de las interacciones entre los PDZ y los ligandos naturales de EBP50. La sustitución del C-terminal del PDZ por el correspondiente C-terminal del ligando da lugar a una molécula quimera, permitiendo caracterizar estructuralmente el complejo PDZ-ligando a partir de la resolución de su estructura. Esta estrategia ha sido empleada con éxito para el análisis estructural de las interacciones del PDZ1 de EBP50 con el C-terminal del CFTR

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Lazo de unión " al carboxilo"

41

(Karthikeyan et al., 2001b), el Receptor β2-Adrenérgico (β2AR) (Karthikeyan et al., 2002), el Receptor del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGFR) (Karthikeyan et al., 2002) y el Receptor de Quimioquinas CXCR2 (Lu et al., 2013). La resolución de estas estructuras ha permitido conocer los determinantes de la especificidad y la afinidad de estas interacciones. En todos los casos los péptidos se insertan mediante “β-sheet augmentation” y establecen numerosos contactos con los residuos de la hebra β2, la hélice α2, así como los lazos β1-β2 y β2-β3 (Karthikeyan et al., 2001b, 2002; Lu et al., 2013) (Fig. 5A). Habitualmente se considera que los enlaces de hidrógeno entre los grupos carbonilo y amida de las cadenas principales del péptido y del PDZ contribuyen a la afinidad de la interacción, mientras que los enlaces entre los residuos de las cadenas laterales intervienen en la especificidad por un ligando (Ivarsson, 2012; Luck et al., 2012; Tonikian et al., 2008). Sin embargo, se ha visto que todos los residuos del péptido contribuyen en mayor o menor medida a la afinidad de la interacción con los dominios PDZ (Tonikian et al., 2008).

Figura 5. Estructuras del dominio PDZ1 de EBP50 unido a algunos de sus ligandos. (A) Visión tridimensional del bolsillo de unión a péptidos del PDZ1 de EBP50 en interacción con el C-terminal de CFTR, β2AR, PDGFR y CXCR2. Los átomos de C, O, y N se muestran en negro, rojo y azul, respectivamente; las moléculas de agua como esferas verdes y los enlaces de hidrógeno como líneas discontínuas rojas. Los residuos en las posiciones 0, -2 y -4 determinan la afinidad, mientras que los contactos de los residuos -1 y -3 son determinantes de la especificidad por el ligando. Adaptado de (Karthikeyan et al.,

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FIG. 2. PDZ1 interaction with the !2AR and PDGFR carboxyl termini. A and B, stereo images of the hNHERF PDZ1 binding pocket bound

to the !2AR (A) and PDGFR (B) carboxyl-terminal ligands. Carbon, oxygen, and nitrogen atoms are shown in black, red, and blue, respectively. Water molecules are depicted as green spheres, and hydrogen bonds are shown as dashed lines. C and D, two-dimensional representations of the

Mode of hNHERF PDZ1 Binding to!2AR and PDGFR

18976

at Centro Nacional de Biotecnologia - Biblioteca, on March 4, 2013

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FIG. 2. PDZ1 interaction with the !2AR and PDGFR carboxyl termini. A and B, stereo images of the hNHERF PDZ1 binding pocket bound

Mode of hNHERF PDZ1 Binding to !2AR and PDGFR

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at Centro Nacional de Biotecnologia - Biblioteca, on March 4, 2013

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A and C).

Structural Basis for the Specificity of the NHERF PDZ1-

CFTR Interaction—The peptide ligand Q95_DTRL99_{inserts into}

the PDZ1 binding pocket antiparallel to the!2 strand and

extends the!-sheet of PDZ1 (Fig. 1, C and D). In this arrange-

ment, the invading pentapeptide is highly ordered, as indicated by the high quality electron density map (Fig. 2A). The car- bonyl oxygen of Gln !4 hydrogen bonds with the amide nitro-

gen of Gly30_{(Fig. 2, B and C), indicating that Gln !4 does not}

contribute to the specificity of the interaction. By contrast, Asp !3, Thr !2, and Leu 0 are engaged in numerous interactions with PDZ1, consistent with biochemical evidence on the central role of these residues in the specificity and affinity of the

NHERF PDZ1-CFTR interaction (8–10). Specifically, the O"1

atom of Asp !3 hydrogen bonds with N"1_{of His}27_{, and the O}"2

atom of Asp !3 forms a salt bridge with N#1_{of Arg}40_{(Fig. 2, B}

and C). Similarly, the amide nitrogen and carbonyl oxygen of Thr !2 hydrogen bond with the carbonyl oxygen and amide

nitrogen of Leu28_{, respectively, while the O}$1_{atom of Thr !2}

hydrogen bonds with the N%2_{atom of the conserved His}72_(Fig.

2, A–C).

The side chain and carboxylate group of Leu 0 enter into a

deep cavity formed by Tyr24_{, Gly}25_{, Phe}26_{, Leu}28_{, Val}76_{, and}

Ile79_{residues (Fig. 1D). The C}"1_{atom of Leu 0 makes hydro-}

phobic contacts with the atoms C%2_{and C}&_{of Phe}26_{and C}"1_of

Ile79_{(Fig. 2C). In addition, the carboxyl oxygen of Leu 0 hydro-}

gen bonds with the amide nitrogens of Gly25 _{and Phe}26_,

whereas the carbonyl oxygen of Leu 0 hydrogen bonds directly

with the amide nitrogen of Tyr24_{and indirectly with the N}&

atom of Arg80_{in the}_'_{2 helix through two ordered water mol-}

ecules (Fig. 2, B and C). The involvement of Arg80_{in carboxy-}

late binding through ordered water molecules represents a novel feature of the PDZ-ligand interaction and differs from other PDZ structures where this function is mediated by an

In document Determinantes estructurales que regulan la función de la isoforma beta de la fosfatidilinositol 4-fosfato 5-kinasa (página 42-49)