Efecto de la depleción del complejo P-TEFb del extracto nuclear sobre la transcripción de los genes del VIH-1 y c-myc

Los resultados anteriores sugieren que Tat, a través de TAR, está reclutando el complejo P-TEFb, estimulando así la elongación transcripcional de los complejos de la RNAPII formados en el promotor del gen c-myc. Para determinar el requerimiento funcional de P-TEFb en la regulación transcripcional del gen c-myc y VIH-1 decidimos estudiar el efecto de la inmunodepleción del complejo P-TEFb de un extracto nuclear sobre la capacidad de éste último de llevar a cabo el proceso de elongación transcripcional.

La inmunodepleción del complejo se llevó a cabo usando un anticuerpo específico contra CDK9, uno de los componentes del complejo P-TEFb. La depleción se realizó en extractos nucleares de células HeLa y en condiciones de alta sal para asegurar una óptima especificidad (Figura 17). Se utilizó para ello una resina comercial con propiedades magnéticas recubierta de proteína A a la que se unieron covalentemente inmunoglobulinas específicas para la proteína CDK9, permitiendo su reutilización en

una segunda ronda inmunodepleción (Figura 17B). La eficiencia y la especificidad en la depleción de CDK9 se comprobaron visualizando ambos componentes del complejo P- TEFb (CDK9 y Ciclina T1) y otros factores nucleares mediante técnicas de WB (Figura 17C). Se obtuvo una depleción de aproximadamente el 90 % de las proteínas CDK9 y Ciclina T1. No se observó una disminución en otras proteínas analizadas del extracto así deplecionado como el factor de splicing U2AF65 o el coactivador transcripcional CA150/TCERG1. El sobrenadante de los extractos control de la depleción tenía niveles de CDK9 y Ciclina T1 similares a los presentes en el extracto sin deplecionar (Figura 17C, carriles 1 y 6).

Figura 17. Inmunodepleción de la proteína CDK9 del extracto nuclear de células HeLa. A) Esquema del proceso de la inmunodepleción tal y como se detalla en el texto y en Materiales y Métodos. B) Comprobación de la unión covalente del anticuerpo anti-CDK9 a la matriz de proteína A con el reactivo dimetil pipelimidato (DMP); electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante de la matriz de proteína A unida al anticuerpo antes y después de la unión covalente del anticuerpo a la matriz; las inmunoglobulinas quedan unidas a la proteína A y no se detectan en el gel. C) Resultados de un análisis por WB del extracto deplecionado específicamente (CDK9
NE) y control (C
NE). Se utilizaron anticuerpos específicos para la localización de las proteínas específicas; las posiciones relativas de éstas están indicadas en la parte derecha del panel, y el peso molecular de los marcadores (M) en la parte izquierda. NE, extracto nuclear de células HeLa.

Los extractos nucleares deplecionados se utilizaron para evaluar el efecto de la ausencia de CDK9 en la actividad transcripcional de los promotores del VIH-1 y c-myc realizando ensayos de transcripción-elongación in vitro. En primer lugar, se comparó la actividad de los extractos durante la transcripción del promotor del VIH-1 en ausencia o presencia de la proteína Tat, modelo en el que se conoce la implicación de CDK9 en su regulación transcripcional (ver Introducción), para después examinar el efecto de la proteína en la transcripción del gen c-myc. Como se aprecia en la Figura 18, la depleción de CDK9 tuvo un efecto negativo sobre la transcripción, siendo su efecto más acusado en fases tardías de la elongación, como se refleja en la disminución preferente de la banda de 377 nt correspondiente a los tránscritos largos y en el valor de la eficiencia de elongación de los complejos transcripcionales (Figura 18A, carril 3. También Figura 18B carril 2). La disminución del nivel de transcripción en los extractos deplecionados de CDK9 en ausencia de Tat apoyaría el modelo del reclutamiento de CDK9 al promotor del VIH-1 independientemente de Tat, probablemente a través de la interacción con componentes del PIC (ver Discusión). En presencia de Tat se observó una activación de la transcripción en los extractos deplecionados, indicando que la fracción de P-TEFb presente en el extracto deplecionado (aproximadamente un 10 %) es reclutada eficientemente por Tat para activar la transcripción del promotor viral en este sistema. (Figura 18A carril 4). Para comprobar si el complejo P-TEFb podía recuperar la capacidad de elongación en los extractos deplecionados de CDK9, las proteínas CDK9 y Ciclina T1 se expresaron en un sistema de baculovirus y se añadieron a los extractos deplecionados. La adición del complejo P-TEFb recombinante a las reacciones de transcripción incrementó la eficiencia de elongación en los extractos deplecionados (Figura 18A, carril 5 y Figura 18B, carril 3), apoyando de nuevo el papel esencial de este complejo en la activación de la elongación transcripcional del VIH-1.

Con el fin de conocer el efecto de la depleción de CDK9 en la transcripción del gen c-myc, se llevaron a cabo reacciones de transcripción-elongación in vitro con el molde de DNA basado en el promotor P2 del gen c-myc. Se utilizó la construcción P2dGless, ya que en los experimentos anteriores habíamos observado que los promotores P1P2 y P2 se comportaban de manera similar en el sistema de transcripción-elongación in vitro y, por lo tanto, decidimos continuar con el promotor más sencillo. La ausencia de CDK9 en los extractos se tradujo en una disminución acusada en el nivel de tránscritos largos y un menor efecto en el nivel de los tránscritos cortos sintetizados (Figura 18B carril 5).

Asimismo, la adición del factor P-TEFb recombinante fue suficiente para recuperar la actividad inicial del extracto deplecionado, como se puede apreciar en la Figura 17B.

Los resultados obtenidos apoyan un papel funcional importante de P-TEFb en la regulación de los genes del VIH-1 y c-myc ya que demuestran que se requiere de dicho complejo para una eficiente entrada en un estado procesivo del complejo de la RNAPII en ambos modelos.

Figura 18. P-TEFb regula la elongación trasncripcional de los genes del VIH-1 y c-myc. A) Las reacciones de transcripción-elongación in vitro se llevaron a cabo con extractos control (C
NE) y deplecionados de CDK9 (CDK9
NE) y el molde HIVdGless en ausencia o presencia de 200 ng de proteína Tat recombinante. Se añadieron 80 ng de P-TEFb recombinante cuando se indica (carriles 5 y 6). B) Las reacciones de transcripción-elongación in vitro se llevaron a cabo con extractos control (C
NE) y deplecionados de CDK9 (CDK9
NE) y los moldes HIVdGless (VIH-1) y P2dGless (c-myc). Se añadieron 80 ng de P-TEFb recombinante cuando se indica (carriles 3 y 6). El análisis y cuantificación de los productos de RNA así como el cálculo de las eficiencias de elongación se realizaron como se indica en la Figura 11. Las flechas indican la migración de los tránscritos largos y cortos. Los marcadores (M) utilizados están descritos en la Figura 11.

1.5. Estudio de la presencia de CDK9 en los PICs formados sobre los