Para elucidar si el patrón presentado por Trk es específico para este transportador en S. cerevisiae o podría extrapolarse a cualquier levadura, se decidió estudiar el doble mutante trk1,2 transformado con una versión del transportador de alta afinidad de Neurospora crassa (NcHAK1). Los resultados para NcHAK1 (Figura 50), a diferencia del doble mutante trk1,2 (la Figura 51 muestra el doble mutante con el plásmido vacío pYGEL15), no muestran una adaptación a las concentraciones externas, pues tanto a alto como a bajo potasio las concentraciones estacionarias internas fueron bastante similares. Estos resultados concuerdan con el hecho de que HAK1 es un transportador de alta capacidad concentrativa en N. crassa (Haro et al., 1999) y es propio de hongos que viven
100 80 60 40 20 0 0.3 0.5 1 10 100 K+ Externo (mM) % K + Int er no
94 % K +Int e r no Tiempo(minutos)
en ambientes con una baja concentración de potasio, lo cual representa una ventaja ecológica, mientras que S. cerevisiae coloniza ambientes con altos contenidos de azúcar, los cuales presentan concentraciones altas de potasio.
Figura 50. Evolución del contenido de potasio en función de la concentración externa en el doble mutante trk 1,2 transformado con una versión del transportador NcHAK1 de
Neurospora crassa. La cepa fue cultivada en 100 mM de KCl, luego resuspendida en diferentes concentraciones del catión y el proceso de adaptación fue seguido a lo largo del tiempo. Las barras de error corresponden a la desviación estándar.
Figura 51. Evolución del contenido de potasio en función de la concentración externa en el doble mutante trk 1,2 transformado con una versión del plásmido vació pYGE15. La cepa fue
cultivada en 100 mM de KCl, luego resuspendida en diferentes concentraciones del catión y elproceso de adaptación fue seguido a lo largo del tiempo. Las barras de error corresponden a la desviación estándar.
95
DO
600
Tiempo(minutos)
Se determinó la densidad óptica en el doble mutante trk 1,2 transformado con una versión del transportador NcHAK1 de Neurospora crassa y también del doble mutante transformado con el plásmido vacío pYGE15 en las distintas concentraciones externas de potasio en relación al tiempo.
Los resultados determinaron que el doble mutante trk 1,2 transformado con una versión del transportador NcHAK1 de Neurospora crassapresentó densidades ópticas muy similares para todas las concentraciones externas estudiadas (Figura 52), lo cual puede explicarse en función de la alta afinidad del transportador NcHAK por el potasio, incluso a bajas concentraciones de potasio, lo que influye en el crecimiento de la cepa. En relación al doble mutante transformado con el plásmido vacío pYGE15, su comportamiento fue similar al doble mutante trk 1,2, en cuanto a las densidades ópticas, lo que confirmó que el plásmido vacío pYGE15 no influyó en el fenotipo del doble mutante (Figura 53).
Figura 52. Cambios en el crecimiento (D.O) en el doble mutante trk 1,2 transformado con una versión del transportador NcHAK1 de Neurospora crassa. La cepa fue cultivada en 100 mM de
KCl, posteriormente resuspendida en diferentes concentraciones de potasio y paralelamente a la determinación del contenido interno, se cuantificó la densidad óptica (DO600). La flecha indica el
96
DO
600
Tiempo(minutos)
Figura 53. Cambios en el crecimiento (D.O) en el doble mutante trk 1,2 transformado con una versión del plásmido vació pFL15. La cepa fue cultivada en 100 mM de KCl, posteriormente
resuspendida en diferentes concentraciones de potasio y paralelamente a la determinación del contenido interno, se cuantificó la densidad óptica (DO600). La flecha indica el punto en que la cepa
fue resuspendida en las distintas concentraciones externas de potasio
También se llevó a cabo el experimento para determinar si las concentraciones estacionarias intracelulares dependían de las condiciones iniciales o estaban determinadas solamente por las concentraciones externas, las células se cultivaron toda la noche en medio YNB-F con diferentes concentraciones externas de potasio y luego se determinó el contenido de potasio, como se presenta en la Figura 54.
Figura 54. Concentración interna de potasio en el doble mutante WΔ6 y WΔ6 transformado con una versión del transportador NcHAK1 de Neurospora crassa. Las cepas fueron cultivadas
toda la noche a diferentes concentraciones externas de potasio. El estado estable en las concentraciones de las Figuras 50 y 51 se indican en cuadrados. El doble mutante no creció a 0,3 mM de KCl, lo que impidió medir las concentraciones internas de potasio. Los experimentos fueron repetidos al menos tres veces. Las barras de error corresponden a la desviación estándar.
0 20 40 60 80 100 0.3 0.5 1 10 100 % K + Int er no K+Externo (mM) WΔ6 HAK WΔ6 K+Externo (mM) % K +Int e r no
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Es interesante resaltar que en el doble mutante transformado con una versión del transportador NcHAK1 de N. crassa, la concentración intracelular de potasio fue aproximadamente de 600 nmol/mg de célula, cuando la concentración externa de potasio era 100 mM de KCl. En concentraciones bajas externas de potasio, la concentración interna fue proporcional a la externa, y de manera similar que en la cepa silvestre coincidió con los estados estacionarios (Figura 38). Interesantemente, a bajas concentraciones externas de potasio (0,3-1 mM), su contenido intracelular fue de 535 nmol/mg de célula, es decir, bastante similar al contenido intracelular de la cepa silvestre y el doble mutante trk1,2, cuando la concentración externa de potasio fue máxima (100 mM KCl), lo que confirma su comportamiento como un transportador de alta afinidad por el potasio, aún cuando la concentración externa del catión sea muy baja. Al comparar WΔ6 con doble mutante transformado con HAK1, se observó una evidente diferencia en su contenido intracelularde potasio, lo que confirma que el patrón presentado por TRK es específico para este transportador en S. cerevisiae.
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DISCUSIÓN