Efecto del pre-tratamiento

Con miras a producir un complejo celulolítico para la degradación de biomasa, se realiza la exploración de pre-tratamientos adecuados que permitan un mayor acceso a la matriz de celulosa por parte de las enzimas. Como la biomasa presenta una baja concentración de lignina se utilizaron pre-tratamientos que se especialicen en el fraccionamiento de las fibras sin la utilización de químicos que puedan aumentar las posibilidades de formación de compuestos no deseados.

El tallo de clavel utilizado proporciona una buena superficie disponible y una probable reducción del grado de polimerización de la celulosa debido al pretratamiento de molienda realizado. Como pre-tratamientos adicionales se propuso la realización de pre- tratamiento con agua caliente y con acido sulfúrico diluido.

El pre-tratamiento con agua caliente, se realiza usualmente a una concentración de sólidos <20%, debido a que se requiere que haya un contacto de la biomasa con al agua en estado líquido. Como resultados se obtiene que ocurre una hidrólisis de la hemicelulosa, despolimeración de la celulosa y una solubilización parcial de la lignina, con una formación baja o nula de inhibidores en el proceso y es un procedimiento que ha sido utilizado para materiales como el bagazo de la caña (Sánchez O. y Cardona C., 2005).

Los intervalos de operación utilizados dependen de la densidad de la biomasa y su composición, la temperatura está entre el intervalo de 170-230°C, el tiempo entre 1-46 min y la concentración de sólidos entre 10-20%. Para el pre-tratamiento se utilizó una concentración de biomasa del 10%, a las siguientes condiciones presentadas en la Tabla

2-7.

Tabla 2-7: Condiciones del pre-tratamiento realizado con agua

Corrida Presión [bar] Temperatura [°C] Tiempo [min]

1 4.1 145 15

2 5.4 155 15

3 6.7 163 20

4 7.0 165 15

5 10.9 183 20

El equipo utilizado fue un reactor de alta presión en acero inoxidable con una válvula de purga y con conexión separada hacia un manómetro para el registro de presión (intervalo de 0-40 bar) (Figura 2-4). La adición de calor al sistema se realizó utilizando una plancha de calentamiento con agitación magnética. Para lograr un buen contacto entre las fases, se utilizó un agitador magnético de 2.5” de largo. El volumen del reactor es de 500 cm3 con un volumen de trabajo de 250 cm3 para dar espacio al equilibrio líquido vapor. El procedimiento utilizado fue el siguiente:

Adición de la biomasa y el agua al reactor. Cerrado hermético del reactor.

Inicio del calentamiento y agitación magnética con la válvula de purga abierta y registro del tiempo.

Cuando se observa salida de vapor por la purga durante 1 min, se cierra la válvula y comienza el inicio de aumento de presión.

Cuando se llega a la presión esperada, se mantiene por el tiempo requerido variando el flujo de calor de la plancha de calentamiento.

Al terminar el tiempo de reacción, se suspende el calentamiento y se pone el sistema en un baño de agua fría.

Cuando la presión del sistema sea cero, y la temperatura del sistema cercana al ambiente se destapa y se recupera la biomasa y el líquido.

La biomasa fue filtrada al vacío a través de membranas de papel con retención de partículas de 12-15 µm. Se lavó con agua destilada y secó hasta peso constante a 70°C.

Figura 2-4: Diagrama del equipo utilizado en el pre-tratamiento con agua caliente

El pre-tratamiento con ácido sulfúrico diluido se ha utilizado para aumentar la digestibilidad enzimática en madera de eucalipto y pastos como A. elongatum y L. triticoides en tamaños de partícula entre 0.23 – 0.38 mm con ácido sulfúrico al 0.9 – 1.4% p/p en tiempos de residencia entre 8-20 min (Zheng Y. et al, 2009) generando una alta digestibilidad del sustrato a la mayor concentración de ácido sulfúrico.

De acuerdo con estas características del proceso se escogió realizar un pre-tratamiento con acido sulfúrico diluido al 2% por 15 min a 121°C en autoclave. La carga de biomasa fue del 10% en peso en frascos de vidrio esterilizables con un volumen de 100 mL, con 4 g de tallo de clavel y 40 mL de solución de ácido sulfúrico. Luego del ciclo de calentamiento, los recipiente se enfriaron en un baño de agua y cuando se llego a la temperatura ambiente, se filtró la solución, lavando con agua destilada para retirar el ácido y los azúcares solubilizados.

A cada pre-tratamiento se le registró la masa de sólidos recuperados y su contenido de sólidos totales. El sólido fue caracterizado en su contenido de azúcares estructurales utilizando hidrólisis con acido sulfúrico y registrando la concentración de azúcares por HPLC. Adicionalmente se recuperó el volumen del líquido y su concentración de azúcares se determinó por HPLC.

Reactor de alta presión Calentamiento Agitación magnética Registro de presión Purga Válvula de Purga

Luego del pre-tratamiento se realizaron experimentos para la producción de enzimas celulolíticas, utilizando la biomasa resultante a una concentración en base seca de 3.64 g/100mL de medio. Se utilizó la misma concentración de sales que las del medio registrado en la Tabla 2-2, pero adicionando el sulfato de amonio a una concentración de 0.5 g/L de acuerdo a los resultados obtenidos en el numeral anterior y antes de esterilizar se ajustó el pH inicial a un valor de 5.0. El crecimiento fue realizado en oscuridad, a 150 rpm y 28 ± 1°C y una concentración inicial de 3*104 esporas/mL. Como control se utilizó un experimento a las mismas condiciones y composición del medio, pero con clavel molido sin ningún otro pre-tratamiento como sustrato. Como variables de respuesta se midió el pH final y la actividad en CMC y Avicel®.