Efecto de la rutina y DMSO sobre la expresión de proteínas sinápticas

La determinación de los efectos del flavonol rutina sobre la expresión de proteínas sinápticas se realizó mediante western blot. En la Fig. 5 se muestran los resultados del western blot para cuatro proteínas luego de la estimulación con rutina (0,1µM). La expresión de las 4 proteínas se vio afectada ya sea por el DMSO o por el tratamiento con rutina o por ambos. En algunos casos el efecto parece ser aditivo mientras que en otros parecen haber efectos contrarios.

En el caso de la Gefirina el efecto de la rutina es mucho más conspicuo que el producido por el vehículo (Fig. 5A y Fig. 6A). Este flavonol provocó una disminución de un 25 % en la expresión de esta proteína comparada con el control. Con respecto a GAD65 (Fig. 5B y Fig. 6B) el efecto del DMSO y de la rutina parece ser aditivo. Ambos parecen aumentar la expresión de esta proteína lo cual concuerda con los resultados obtenidos del área e

intensidad de puncta mas arriba. La rutina y el DMSO tuvieron efectos contrarios sobre la expresión de PSD-95 (Fig. 5C y Fig. 6C). El DMSO disminuyó la expresión de esta proteína en un 20 % mientras que cuando se aplicó el tratamiento con rutina la expresión se disparó un 30 % más que el control. Por último, la expresión de la Sinapsina 1 pareció ser solamente afectada por el DMSO. En la Fig. 5D se aprecia que la intensidad y el área de las bandas del control y del tratamiento con rutina son muy similares. Pero la banda correspondiente a control del vehículo es prácticamente invisible. La expresión de la Sinapsina fue de alrededor de 14 veces menos que el tratamiento con rutina Fig. 6D.

Figura 5 – Efecto de la rutina sobre la expresión de proteínas sinápticas. (A) Gefirina, (B) GAD65, (C)

PSD-95 y (D) Sinapsina 1. La punta de flecha en A representa una banda dañada correspondiente a un control de carga.

Figura 6 – Cuantificación de las proteínas sinápticas presentes en la Fig. 5. (A) Gefirina, (B) GAD65, (C)

PSD-95 y (D) Sinapsina 1. En D se normalizó con respecto al vehículo ya que la banda del control en esa película fue dañada e imposibilitaba un análisis apropiado. En A y D en la barra que representa el tratamiento con rutina se obtuvieron 2 réplicas. Los datos se presentan como la densidad relativa (% del control) ± s.e.m (donde hay barra de error).

Figura 6 – Cuantificación de las proteínas sinápticas presentes en la Fig. 5. (A) Gefirina, (B) GAD65, (C)

PSD-95 y (D) Sinapsina 1. En D se normalizó con respecto al vehículo ya que la banda del control en esa película fue dañada e imposibilitaba un análisis apropiado. En A y D en la barra que representa el tratamiento con rutina se obtuvieron 2 réplicas. Los datos se presentan como la densidad relativa (% del control) ± s.e.m (donde hay barra de error).

5. DISCUSIÓN

5.1. Efecto de la rutina y quercetina sobre la viabilidad de neuronas corticales in vitro

La rutina y la quercetina generaron efectos contrarios sobre la supervivencia neuronal. La quercetina 100µM por un lado, produjo un efecto negativo sobre la viabilidad celular luego de 24 horas (Fig. 2A) de tratamiento. Este efecto se atenuó luego de 48 horas (Fig. 2B). Otros estudios también han reportado el efecto de este flavonol sobre células neuronales. Por ejemplo, Spencer, Kuhnle, Williams, & Rice-Evans (2003) observaron una reducción de mas del 50 % de la viabilidad de neuronas corticales luego de tratarlas con quercetina 30 µM durante 18 horas. Esto sugiere que la toxicidad de la quercetina en neuronas corticales comienza a presentarse a concentraciones entre 1 y 30 µM.

La quercetina ejerce algunos efectos detrimentales sobre las células los cuales podrían explicar la disminución en la viabilidad neuronal que aquí se presenta. Entre ellos se listan daño al ADN, incremento de la actividad de la caspasa-3, apoptosis y la formación de superóxidos (Spencer, Rice-Evans, & Williams, 2003). Además, podrían estar involucradas también las vías de señalización de las MAPKs y PI3Ks. La quercetina tiene la habilidad de inhibir estas vias lo cual podría mediar efectos neurotóxicos. La atenuación a la 48 horas puede deberse a una inhibición sostenida e irreversible de Akt, esto puede ser producido por la quercetina a concentraciones de al menos 30 µM y produce la activación de la caspasa-3 (Spencer, Rice-Evans, & Williams, 2003; Spencer, 2007).

La rutina, por el contrario, generó un aumento en la viabilidad celular a concentraciones de 0,1µM. En otros estudios como Yoo, Ku, Baek, & Bae (2014) no se observaron efectos en la viabilidad de celulas HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) estimuladas con rutina (3 – 100 µM) por 24 horas. Por otro lado, Jader et al. (2012) reportó un aumento en la viabilidad de células de cresta neural expuestas a rutina (20 – 30 µM). Estos últimos atribuyen este aumento al incremento general del número de celulas. Sin embargo, este no parece ser el caso en cultivos primarios neuronales dado que las neuronas maduras no llevan a cabo

divisiones celulares (Gordon, Amini, & White, 2013). Por ello es más probable que el aumento que aquí se observa se deba a una reducción en la muerte celular, es decir, un efecto protector por parte de la rutina a la concentración de 0,1 µM.

El efecto de la rutina podría estar relacionado con la activación de vias de señalización antiapoptóticas y el secuestro de agentes oxidantes en el cultivo. Tanto la vía de las MAPKs como las PI3Ks son activadas por algunos flavonoides a concentraciones que como aquí se muestran parecen ser del rango nanomolar. La activación de estas vías, principalmente la segunda, está relacionada con la supervivencia (Middleton , Kandaswami, & Theoharides, 2000; Spencer, 2007) lo cual pudo en este caso disminuir la muerte celular en los cultivos. Además, a bajas concentraciones los favonoides pueden activar el factor prosupervivencia CREB, genes de superviviencia (c-Fos, c-Jun) y genes detoxificantes resultando en mecanismos de protección (Spencer, Rice-Evans, & Williams, 2003; Spencer, 2007). Estas vías de señalización pueden activarse de manera reversible y no sostenida cuando son estimuladas por bajas concentraciones de flavonoides. Esto podría explicar porque luego de 48 horas el efecto desaparece.

A pesar de que la rutina y la quercetina poseen un esqueleto químico similar, los cambios en las sustituciones que ellas presentan las dota de propiedades fisicoquímicas distintas. Estas diferencias podrían traducirse en la interacción o no con distintos receptores de membrana y moleculas citoplasmáticas que mediarian los cambios observados y explicando los efectos contrarios que produjeron estos dos flavonoles.

5.2. Estandarización del inmunomarcaje de la proteína Gefirina

Dado que entre los protocolos de las Figs. 3A – D y las Figs. 3E – F las únicas variables que cambian son el tiempo de permeabilización y la concentración de Triton X-100 es de suponer que una de ellas o su combinación son críticas para el funcionamiento de esta técnica. Variaciones pequeñas en la concentración de Triton X-100 pueden causar cambios

significativos en la calidad del marcaje (Neely, Stanwood, & Deutch, 2009) con el anticuerpo primario y por ello este debe ser estandarizada en cada caso.

El Triton x-100 es un detergente no iónico con capacidad surfactante y emulsificadora. Debido a su carácter detergente es utilizado para permeabilizar membranas celulares en técnicas como la inmunocitoquímica. Sin embargo, la desventaja del Triton X-100 y en general de los detergentes es que estos pueden extraer proteínas junto con los lípidos de manera inespecífica (Jamur & Oliver, 2009). Esto pudo generar en nuestro caso que la concentración de 0,3 % v/v fuera muy alta y causara la desestabilización de la membrana dendrítica teniendo en cuenta la estructura delgada de las mismas haciendo que estas se desintegraran dejando muchos residuos y resultando en imágenes como la mostrada en las Figs. 3F – G en la cual se reconoce el soma pero a su alrededor una red densa de lo que sería trozos de dendritas.

La puncta visible en Figs. 3A – D representan altas concentraciones locales de la Gefirina autoensamblada y son llamadas clústeres. Estos se concentran principalmente en sinapsis GABAérgicas y glicinérgicas (Tyagarajan & Fritschy, 2014) del lado postsináptico. Debido a ello es de suponer que las estructuras ramificadas provenientes de los somas y marcadas también en verde corresponden a dendritas y estas puncta a terminales inhibitorios postsinápticos. Las neuronas observadas pueden ser tanto inhibitorias como excitatorias dado que ambas expresan esta proteína.

Dada la clara visualización de las puncta de Gefirina, las dendritas y el soma se concluyó que pequeñas variaciones en la concentración de Triton x-100 y el tiempo de permeabilización son críticos para el marcaje con este anticuerpo. No se reconocen diferencias aparentes entre los tratamientos de las Figs. 3A – B y Figs. 3C – D y en general la calidad de los mismos es suficiente para contar sinapsis utilizando además un marcaje contra una proteína presináptica.

5.3. Efecto de la rutina y DMSO sobre el área, la intensidad y la densidad de puncta de GAD65

Tanto el área de las puncta (Fig. 4A – B) como la intensidad (Fig. 4C – D) fue aumentada por la rutina y por el DMSO de manera significativa. La densidad (Fig. 4E – F) sufrió un cambio similar pero este no fue significativo. Es posible que el vehículo haya estado contaminado con algún compuesto el cual generó los efectos o que el mismo DMSO haya provocado este aumento. De cualquier manera, dado los resultados obtenidos es difícil decir que los efectos fueron producto de la rutina.

El DMSO es un solvente orgánico comunmente utilizado. Este ha mostrado tener distintos tipos de actividad biológica como las listadas a continuación: neuroprotección (100 %, 1 ml/kg; Di Giorgio et al, 2008), en células de adenocarcinoma humano el DMSO (2 % v/v) genera modificaciones morfológicas y diferencias en las glicoproteínas membranales (Kim et al, 1980), la aplicación (2 %) a mioblastos por 72 horas inhibe completamente la inducción de la fosfoquinasa creatina (un indicador de la diferenciación muscular; Miranda, Nette, Khan, Brockbank, & Schonberg, 1978). El tratamiento con DMSO (1 – 2 % v/v) a células de neuroblastoma de ratón resulta en una producción de cultivos morfológicamente diferenciados por la formación de procesos extensos (Kimhi, Palfrey, Spector, Barak, & Littauer, 1976). Este solvente también inhibe la conducción axonal en varios tipos celulares (0,44 – 70 %; Sawada & Sato, 1975 ) y Gómez (2014) encontró que el DMSO produce un aumento en la fosforilación de Akt y de Erk, es decir podría haber una activación de las vías MAPKs y PI3Ks por parte de este solvente. Todos estos reportes hacen palusible que el efecto que aquí se observó sea producto del vehículo.

La proteína GAD65 se encuentra predominantemente en los terminales sinápticos (Sánchez- Huertas & Rico, 2011). En el ANEXO 2 se pueden apreciar puncta conspicuas de lo que presumiblemente son terminales presinápticos inhibitorios. El área de estas puncta podría reflejar el tamaño los terminales y este, a su vez, estar relacionado con procesos de plasticidad neuronal. La intensidad de los marcajes, por otro lado refleja la concentración de

antígenos (Mortensen & Larsson, 2001) y de manera indirecta la expresión de la proteína. Con respecto a la intensidad, los niveles de mRNA de GAD65 y de proteína están modulados por BDNF y el receptor TrkB a través de la cascada de señalización de las MAPKs/Ras/ERK (Sánchez-Huertas & Rico, 2011). Siendo así puede que los resultados que se observan aquí sobre el área, la intensidad y las puncta de GAD65 pueden estar mediados por algún tipo de interacción entre el DMSO y la cascada de señalización MAPKs/Ras/ERK. Sin embargo, no se descartan efectos aditivos o sustractivos producto de la rutina en conjunto con el DMSO.

5.4. Efecto de la rutina y DMSO sobre la expresión de proteínas sinápticas

A pesar de utilizar otro DMSO por la sospecha de contaminación (Sigma-Aldrich: D2650). La expresión de las proteínas evaluadas fue de nuevo afectada por el vehículo. Sin embargo en este caso los resultados son más difíciles de interpretar dado que para cada caso parecen haber distintas interacciones entre la rutina y el vehículo.

La expresión y el funcionamiento de estas proteínas depende en gran medida de la cascada de señalización de las MAPKs (Sánchez-Huertas & Rico, 2011; Yoshii & Constantine-Paton, 2014; Vicario-Abejón , Owens, McKay, & Segal, 2002). Es posible que los distintos efectos observados sobre estas proteínas se deban a interacciones de la rutina con esta vía al mismo tiempo que el DMSO modula la misma.

Estos resultados muestran que tanto el DMSO como el flavonol rutina tienen la capacidad de modular la expresión y la organización funcional de múltiples proteínas sinápticas. Dichos cambios en la expresión proteica pueden llevar a cambios funcionales a nivel sináptico. Por ejemplo, el aumento en la expresión de las proteínas PSD-95 y Gefirina se traduce en el aumento de terminales excitatorios e inhibitorios y posiblemente en un aumento en el número de sinapsis de ambos tipos (Yu & Blas, 2008). Esto le confiere a estos compuestos un enorme potencial como moduladores de múltiples procesos neuronales a nivel celular los cuales son la base de los procesos cognitivos.

6. CONCLUSIONES

En primer lugar, tanto la rutina como la quercetina tienen la capacidad de modular aspectos celulares que se traducen en cambios en la supervivencia neuronal in vitro. La rutina mostró un efecto neuroprotector lo cual la convierte en un candidato para investigaciones terapéuticas.

Por otro lado, la rutina y el solvente DMSO parecen modular también aspectos relacionados con la función sináptica (quizás mediante las mismas vías). Estos produjeron cambios en la expresión de cuatro proteínas sinápticas tanto inhibitorias como excitatorias posiblemente mediante la interacción con vías de señalización celular como las MAPKs.

7. RECOMENDACIONES

Para entender mejor los efectos que produce la rutina sobre las variables medidas se hace necesario hallar un solvente que no presente efectos como los que aquí se observaron. Además, en algún estudio futuro se debe tener muy en cuenta la densidad de siembra de las células en los experimentos de inmunocitoquímica y utilizar un método de cuantificación de proteínas cuantitativo. Si la interacción de la rutina con vías de señalización se produce a nivel de membrana en el lado extracelular y su solubilidad es suficiente para ser diluida en medio neurobasal directamente o si esta posee la capacidad de atravesar la membrana celular, se podría evitar la necesidad de un vehículo el cual podría generar resultados no tan limpios como los aquí mostrados.

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