Efecto del silenciamiento génico de la SMS1 y SMS2 sobre las uniones adherentes

En una segunda etapa del estudio, para confirmar el efecto de la inhibición farmacológica de la actividad de las SMSs sobre las UA, y analizar en grado de participación de cada enzima en el mantenimiento de estas estructuras, se realizaron experimentos de silenciamiento génico utilizando ARN de interferencia pequeños (siRNA) específicos para la SMS1 y 2. Para ello, a las 48 hs de crecimiento, cuando las células habían adquirido un alto grado de unión entre ellas, se realizaron las transfecciones con los siRNA específicos para la SMS1 o SMS2, conjuntamente con un siRNA conjugado con AlexaFluor 488 (siRNA control o scrambled) que no reconoce ningún ARNm en las células. Las células tratadas solo con el siRNA scrambled fueron utilizadas para evaluar si el proceso de transfección provocaba alguna alteración en las estructuras de adhesión. De esta forma, las células que exhibieron puntos fluorescentes de color verde en el citosol fueron consideradas positivas para la transfección. El análisis de las células se realizó mediante microscopía de contraste de fases e inmunomarcación con un anticuerpo dirigido contra α-catenina.

En la Figura 38A, se muestran las células transfectadas con el siRNA scrambled. En las células inmunomarcadas se observa que α-catenina delimita los bordes celulares, reflejando la integridad de las uniones intercelulares, hecho que también se observa en las imágenes de contraste de fase (Figura 38D). Por los tanto, el proceso de transfección no alteró el comportamiento de las células en el cultivo primario. Por el contrario, las células que incorporaron el siRNA específico para la SMS1 presentaron una distribución de α-catenina discontinua en los bordes celulares, lo que refleja una alteración en las uniones célula-célula (Figura 38B, flechas). Estas alteraciones sobre las uniones célula-célula también pueden observarse en las imágenes de contraste de fase (Figura 38E). En las células transfectadas con el siRNA específico para la SMS2, no se observaron cambios en la distribución de α-catenina en los bordes celulares, hecho que también es coincidente en las imágenes de microscopia de contraste de fase (Figura 38C y F).

Resultados

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Figura 36-Efecto de la inhibición farmacológica de las SMSs sobre las estructuras de adhesión célula- célula. Descripción en página 78.

Resultados

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Figura 37-Efecto de la inhibición farmacológica de las SMSs sobre las estructuras de adhesión célula- célula. Descripción en página 78.

Resultados

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Figura 36-Efecto de la inhibición farmacológica de las SMSs sobre las estructuras de adhesión célula- célula 1. Las células fueron incubadas en presencia de un inhibidor de la SMS1 y 2, D609; en las

concentraciones indicadas, y posteriormente inmunomarcadas con anticuerpos dirigidos contra vinculina (verde) y contra α-catenina (rojo). En la segunda columna de imágenes (central) se muestran las ampliaciones de las zonas indicadas en recuadros La tercera columna corresponde a las imágenes de segmentación de las figuras no ampliadas, que indican la colocalización de las proteínas en color blanco sobre un fondo negro. Se muestran imágenes de microscopia confocal tomadas con un objetivo de 60X. Barra: 20µm.

Figura 37-Efecto de la inhibición farmacológica de las SMSs sobre las estructuras de adhesión célula- célula 2. Las células fueron incubadas en presencia de D609 en la concentración de 50 μM, y posteriormente

inmunomarcadas con anticuerpos dirigidos en (A) y (B) contra α-catenina (rojo) y β-catenina (verde), y en

(C) y (D) contra β-catenina (verde) y E-cadherina (rojo). Los núcleos fueron coloreados con Hoechst 33258

(azul). Se muestran imágenes de microscopia de fluorescencia convencional con objetivo de 40X. En la segunda columna de imágenes (central) se muestran las ampliaciones de las zonas indicadas en recuadros, y la tercera columna corresponde a las imágenes de segmentación de las figuras no ampliadas, que indican la colocalización de las proteínas en color blanco sobre un fondo negro. Barra: 100 µm.

Sobre la base de los resultados expuestos, se puede interpretar que la actividad de la SMS1, y no de la SMS2, es la necesaria para el mantenimiento de las uniones adherentes entre las células del TC de la papila renal.

1.3- Efecto de la inhibición de la actividad de las SMSs sobre las proteínas que forman parte de las uniones adherentes

Las células requieren del funcionamiento y expresión constante de las proteínas que forman parte de las UA para mantener la asociación y organización de un epitelio [13]. Se sabe que las UA mantienen un activo recambio de las proteínas del comple o adherente a través de la internalización del comple o de adhesión por la vía endocítica, con su posterior recicla e vía vesicular. También se sabe que E-cadherina presenta una vida media de 5-10 h en el complejo adherente. Por ello, la síntesis y el eficiente tráfico vesicular de E-cadherina resulta fundamental para el mantenimiento de las estructuras de adhesión célula-célula, y por ende del estado diferenciado [137, 138].

Es por este motivo que se estudió si el deterioro en las uniones intercelulares inducido por la inhibición de las SMSs se debe a una alteración en los niveles de las proteínas que forman parte de las UA. Para ello se analizó mediante Western Blot la cantidad de vinculina, E-cadherina, y α- y β-catenina en las células incubadas con una concentración de 50 μM de D609. Como se muestra en la Figura 39, la cantidad de vinculina y α-catenina aumentó significativamente en

Resultados

79 las células tratadas con el inhibidor mientras que no se produjeron cambios significativos en los niveles de E-cadherina y β-catenina. Estos resultados sugieren que las alteraciones observadas sobre las UA inducidas por el inhibidor D609 no se pueden atribuir a la disminución de los niveles de las proteínas que forman estas estructuras.

Figura 38- Efecto del silenciamiento génico de la SMS1 y 2 sobre las estructuras de adhesión célula- célula. Las células del cultivo primario fueron transfectadas con los siRNA específicos para SMS1 o SMS2,

conjuntamente con un siRNA conjugado con AlexaFluor 488 (siRNA scrambled). La fluorescencia verde correspondiente al siRNA scrambled permitió localizar las células transfectadas. En A, B y C se muestran las células inmunomarcadas con un anticuerpo dirigido contra α-catenina (rojo), y en D, E, F las imágenes correspondientes al mismo campo obtenidas mediante microscopia de contraste de fases. Los núcleos fueron coloreados con Hoechst 33258 (azul). Las flechas muestran alteraciones en las uniones intercelulares. Tanto las imágenes de fluorescencia como las de contraste de fases fueron captadas con objetivo de 40X. Barra: 100 µm.

Resultados

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Figura 39- Efecto de la inhibición de la actividad de las SMSs sobre el contenido intracelular de las proteínas que forman parte de las uniones adherentes. Las células fueron incubadas con D609 en la

concentración de 50 M. Para realizar el Western Blot, se sembraron iguales cantidades de proteínas totales (50 µg) en cada condición experimental y se utilizaron anticuerpos dirigidos contra las proteínas indicadas. Los resultados están expresados como porcentaje del control (100%) y corresponden a la media ± error estándar de tres experimentos. *Diferencias significativas con respecto al control. pNS= diferencia no significativa en los valores de las medias con respecto al control.

2. ESTUDIO DE LA PARTICIPACIÓN DE LAS ENZIMAS QUE SINTETIZAN ESFINGOMIELINA EN EL MANTENIMIENTO DE LAS ESTRUCTURAS DE