ELECTROFORESI DE DNA

Els fragments de DNA amplificats per PCR són analitzats mitjançant electroforesi en gels d’agarosa o d’acrilamida.

5.1. Electroforesi en gels d’agarosa/TBE/Bromur d’etidi

L’electroforesi en gels d’agarosa és un tècnica útil per a la separació analítica o preparativa de fragments de DNA de mides entre 100 pb i 25 Kb. La visualització dels fragments de DNA obtinguts s’aconsegueix mitjançant la incorporaci ó al gel d’un colorant fluorescent que s’intercala entre les dues cadenes del DNA. Aquest colorant (en el nostre cas el bromur d’etidi) revela la presència d’una banda de DNA o RNA amb una fluorescència taronjada quan és il· luminat amb llum ultraviolada de longitud d’ona curta (310 nm). La tècnica és molt sensible i permet detectar en un gel 5 ng de DNA.

La resolució dels gels d’agarosa ve modulada per la seva concentració, d’aquesta manera es pot discriminar entre bandes de mides moleculars properes mitjançant un increment en la concentració d’agarosa. Per aquest treball s’han utilitzat de forma rutinària gels amb una concentració d’agarosa que oscil· la entre 0,7% i 4%. El pes molecular de les bandes obtingudes s’interpola sobre una recta de regressió realitzada mitjançant dades de migració electroforètica de bandes de pes molecular conegut, ja que la migració és proporcional al logaritme del pes molecular. S’ha utilitzat el marcador de pes molecular de 1 Kb (Gibco-BRL).

Preparació del gel

Per a gels d’entre 0,7-2% d’agarosa, l’agarosa utilitzada va ser Serva (Boehringer Ingelheim). En els gels de major concentració 3-4% s’ha utilitzat, a parts iguals, agarosa UltraPure (Gibco BRL) i agarosa de baix punt de fusió UltraPure (Gibco BRL).

Fondre l’agarosa nece ssària en una solució que conté el tampó d’electroforesi (TBE 1x). Afegir a la solució atemperada, el bromur d’etidi necessari per tal d’arribar a una concentració final de 0,5 µg/mL. Aquest gel també es pot preparar

sense el bromur d’etidi realitzant, una vegada acabada l’electroforesi, una tinció submergint el gel en una solució de bromur d’etidi i aigua destil· lada.

†

Dipositar l’agarosa fosa en un motlle amb la pinta corresponent la qual, formarà els pous on es carregarà la mostra una vegada l’agarosa estigui solidificada.

†

Col· locar el gel en una cubeta d’electroforesi i afegir TBE 1x fins que quedi cobert.

†

Preparar les mostres barrejant-les amb una solució de blau de bromofenol que ens servirà com a colorant i que proporcionarà pes a les mostres per tal que aquestes caiguin dintre del pou.

†

Carregar les mostres juntament amb un marcador de pes molecular.

†

Connectar al corrent tenint en compte que el DNA té càrrega negativa i que per tant, migrarà sempre des del pol negatiu al positiu.

†

Visualitzar en un transil· luminador de llum ultraviolada.

†

Fotografiar el gel. Solucions

TBE 10x Blau de bromofenol

Tris 900 mM Blau de Bromofenol 0,25%(BioRad) Àcid Bòric (Merck) 720 mM Sacarosa (Merck) 40%

EDTA 24 mM Carregar 1:5; blau:mostra Ajustar pH 8,3 amb àcid acètic (Merck)

TBE 1x: dilució TBE 10x 1:10 5.2. Electroforesi en gels d’acrilamida

De la mateixa manera que amb els gels d’agarosa, la utilitat d’aquests gels és la de separar per mida les molècules de DNA quan aquestes estan sotmeses a un camp elèctric. Els gels d’acrilamida es fan servir quan la mida dels fragments que es pretén visualitzar és molt petita, o bé quan es vol separar fragments que es diferencien per un o molt pocs parells de bases. La manera de visualitzar el DNA en aquests gels pot variar depenent de la seva aplicació: tinció amb bromur d’etidi, radioactivitat, tinció amb nitrat de plata, quimioluminiscència o fluorescència.

Els gels d’acrilamida es poden realitzar en condicions desnaturalitzants o no desnaturalitzants, depenent de la tècnica que es realitzi. La temperatura a la qual la meitat de les molècules de DNA han passat al estat desnaturalitzat, es denomina temperatura de fusió (Tm) i varia segons el percentatge de G+C. Com major sigui aquest percentatge major és la Tm. Per desnaturalitzar el DNA es poden utilitzar diversos mètodes:

‡

Calor.

‡

Compostos químics: la urea i la formamida són agents desnaturalitzants perquè interfereixen reaccionant directament amb les bases impedint un correcte aparellament entre elles a temperatures a les que normalment estarien aparellades. La Tm es redueix proporcionalment amb la concentració d’ag ent desnaturalitzant. El formaldehid és un agent desnaturalitzant amb una acció irreversible, ja que estableix unions covalents amb els grups NH2 de les bases impedint l’aparellament entre elles. A més, pot reaccionar amb el DNA a temperatura ambient. La renaturalització és un procés a l’atzar en el que les molècules desnaturalitzades no renaturalitzen amb els seus complementaris originals, sinó que ho fan amb qualsevol molècula present formant un híbrid estable. Aquest fenomen s’utilitza en diverses tècniq ues.

En general, el protocol de preparació d’aquests gels és el següent:

‡

Netejar bé, amb aigua i sabó, els vidres a utilitzar. Assecar i netejar-los vigorosament amb etanol absolut per tal d’evitar que quedin partícules de gels anteriors.

‡

Muntar els vidres amb els separadors adients i subjectar amb pinces (gels petits) o amb una goma (gels grans).

‡

Afegir a la solució d’acrilamida que volem utilitzar APS al 0,5% (Persulfat amònic, Rio-Rad) i TEMED també al 0,5% (N,N,N’,N’ -tetrametil etilen diamina, Bio-Rad).

‡

Carregar immediatament aquesta barreja entre els vidres utilitzant una xeringa i col· locar la pinta.

‡

Deixar polimeritzar a temperatura ambient (aproximadament 1 hora).

‡

ˆ

Preequilibrar el gel a les condicions en les que es realitzarà l’elect roforesi durant 15-20 min.

ˆ

Desnaturalitzar les mostres durant 2 min a 95ºC amb el tampó de càrrega corresponent i mantenir-les en gel fins al moment de carregar-les. Aquest tampó pot contenir com a colorant blau de bromofenol únicament o barrejat amb xil· lè cianol (Bio-Rad).

ˆ

Es carreguen les mostres en el gel i es posa en marxa l’electroforesi.

ˆ

La solució d’acrilamida, el tampó de càrrega i les condicions d’electroforesi variaran segons l’estudi.

6. MANIPULACIÓ ENZIMÀTICA DEL DNA