CAPÍTULO IX. EVALUACIÓN DE SÍLICES MESOPOROSAS
ZONA DE IONIZACIÓN MALD
I.4.3 Electroforesis capilar
La CE es una técnica de separación basada en la diferente velocidad de migración de las sustancias a analizar en el interior de un tubo capilar bajo la acción de un campo eléctrico. La separación se fundamenta en dos fenómenos físico-químicos: la electroforesis y la electroósmosis.
La electroforesis es la responsable de la diferente migración de los iones de la muestra en el seno de una disolución conductora cuando se les somete a la acción de un campo eléctrico determinado. Esta migración, denominada “movilidad electroforética”, discrimina entre las diferentes sustancias en función de la relación carga/tamaño de las mismas y hace que las sustancias cargadas tiendan a moverse hacia el polo de signo contrario al de su carga, con mayor velocidad cuanto más carga efectiva tengan y menor tamaño posean. El otro fenómeno que interviene en la separación en CE, el cual es independiente de las especies analizadas es la “electroósmosis”. Este fenómeno tiene lugar en el interior de los capilares de sílice y se origina como consecuencia de la ionización de los grupos silanoles de la sílice (Si-OH) por encima de pH 2, formándose
grupos Si-O- con cargas negativas. Este exceso de cargas negativas en la pared del capilar
se neutraliza parcialmente con los iones positivos de la disolución electrolítica (BGE), que se organizan en el interior del capilar formando una doble capa (capa Stern, fija, y capa difusa, móvil). Como consecuencia de ello, al aplicar el campo eléctrico, esta organización de cargas positivas hace que el conjunto de la disolución electrolítica se desplace hacia el polo negativo (cátodo) arrastrando las moléculas y especies que estén en su interior, generando el denominado “flujo electroosmótico” (EOF). Por tanto, la movilidad de un determinado analito se deberá a la resultante de la movilidad electroforética y del EOF,
cada uno de ellos con su signo (ver Figura I.18).
+ + + + + + + + + + + + + +
+
-
+ + + + + + + + + + + + + + - - - - - - - - ++ + + + + + + + + + + N N N N N N - - - - - - - - - - - EOFCapa fija Stern Capa difusa Pared del capilar
Figura I.18. Representación de la movilidad electroforética y electroosmótica en la separación de analitos aniónicos, catiónicos y neutros.
La instrumentación básica empleada en CE consta de una fuente de alto voltaje que aplica una diferencia de potencial entre dos electrodos de platino, un amperímetro, un capilar, recipientes para el medio de separación (tampón) y la muestra y un detector. Los sistemas comerciales incorporan además un sistema para el control de temperatura en muestras y capilar, un muestreador automático que permite la automatización de los análisis, así como, el software necesario para el tratamiento de datos.
Los capilares, en cuyo interior se lleva a cabo la separación, son normalmente de sílice fundida y están recubiertos de poliimida para aportar flexibilidad y resistencia al capilar. El diámetro interno de capilar se encuentra entre 25 y 100 µm y con una longitud a partir de los 25 cm. Para llevar a cabo el análisis, el capilar se llena con un BGE, que consta al menos de un tampón que constituye el medio conductor de la corriente eléctrica y al cual se pueden añadir otro tipo de sustancias dependiendo del modo de separación en el que se trabaje. A continuación, se inyecta una pequeña cantidad de muestra, empleando una de las formas de inyección (hidrodinámica o electrocinética), simplemente cambiando uno de los viales de BGE por el vial que contiene la muestra. Una vez inyectada la muestra, los
dos extremos del capilar se sumergen en la disolución de BGE contenida en dos recipientes, en los cuales además están sumergidos los electrodos entre los que se aplica la diferencia de potencial mediante la fuente de alto voltaje.
Una vez que se lleva a cabo la separación, los analitos se detectan en continuo
directamente en el capilar (detección on column) o al final del mismo (detección end
column). La detección on column se emplea para los detectores UV-Vis, fluorescencia y
resonancia magnética nuclear, mientras que la detección end column se utiliza con
detectores de MS, electroquímicos y Raman. Los detectores UV-Vis son los que más se utilizan por su simplicidad, versatilidad, bajo coste relativo y características no destructivas. Además, el empleo de detectores de diodos en serie permite obtener información adicional como son la pureza de pico e información estructural [20].
I.4.3.1 Modos de separación en electroforesis capilar
Una de las características más importantes de la electroforesis capilar es su aplicación a la separación de una gran variedad de compuestos y a la resolución de diversos problemas analíticos y esto se debe en gran medida a los diversos modos de separación que la técnica ofrece.
Los distintos modos de separación empleados en CE se pueden clasificar en dos grandes grupos: modos que se basan únicamente en principios de separación electroforéticos, en el que se incluyen la electroforesis capilar de zona (CZE), la electroforesis capilar en gel (CGE), el isoelectroenfoque capilar (CIEF), la isotacoforesis capilar (CITP) y la electroforesis capilar en medio no acuoso (NACE), y modos que combinan principios de separación electroforéticos y cromatográficos, en el que se incluyen la cromatografía electrocinética (EKC) y la electrocromatografía capilar (CEC). La
Tabla I.6 agrupa los distintos modos de separación en CE así como el principio de separación específico de cada uno de ellos.
Tabla I.6. Modos de separación en CE.
Modo de CE Mecanismo de separación
Electroforesis capilar de zona (CZE) Movilidad electroforética
Electroforesis capilar en gel (CGE) Tamaño y carga
Isoelectroenfoque capilar (CIEF) Punto isoeléctrico
Isotacoforesis capilar (CITP) Movilidad electroforética entre zonas Electroforesis capilar en medio no acuoso
(NACE) Movilidad electroforética en medios no-acuosos
Cromatografía electrocinética (EKC) Reparto en una pseudofase Electrocromatografía capilar (CEC) Reparto en una fase estacionaria
A continuación se explicará brevemente cada uno de los modos de separación, aunque EKC y CEC se explicarán más detalladamente por ser los dos modos empleados en este trabajo de investigación.
Electroforesis capilar de zona (CZE)
Es el modo de separación más empleado debido a su versatilidad, sencillez y poder de separación. Sin embargo, en principio tiene la limitación de ser útil sólo para especies cargadas, no permitiendo separar especies neutras [115]. En CZE el capilar contiene sólo un medio tamponado, de manera que la movilidad electroforética de los analitos depende fundamentalmente de la relación carga/masa. En estas condiciones, la separación de los distintos analitos se basa en las diferencias existentes en las velocidades electroforéticas de éstos y es posible separar simultáneamente cationes y aniones, siempre que el EOF sea suficientemente elevado para arrastrar ambos tipos de sustancias hacia el detector.
Electroforesis capilar en gel (CGE)
La electroforesis capilar en gel combina la buena resolución de la electroforesis en gel tradicional con la sencilla instrumentación empleada en CZE.
En CGE el capilar de separación se rellena con un gel con un tamaño de poro conocido que actúa como un tamiz molecular. El principio de separación se basa en las diferentes movilidades de los componentes de la muestra a través de los poros del gel en función de su tamaño molecular [116], de manera que los analitos de menor tamaño atravesarán más fácilmente el gel y presentarán tiempos de migración más pequeños y los analitos con un mayor tamaño atravesarán el gel más lentamente llegando al detector en último lugar.
Este modo de separación se aplica principalmente a sustancias que poseen una relación carga/masa similar pero diferentes masas moleculares, como biopolímeros (DNA), proteínas (complejos SDS-proteína) y carbohidratos.
Isoelectroenfoque capilar (CIEF)
Se diferencia de los demás modos de CE en que la separación no se basa en las diferencias de movilidades electroforéticas, sino en las diferencias en los puntos isoeléctricos (pI) de los solutos. Se utiliza para la separación de péptidos, proteínas,
aminoácidos y otras sustancias de carácter anfótero.
La separación por CIEF se basa en la migración electroforética de sustancias anfóteras en un gradiente de pH que se obtiene mediante una disolución de anfolitos (sustancias de
carácter zwitteriónico de diferentes valores de pKa). Al aplicar el campo eléctrico, se
establece un gradiente de pH en el interior del capilar que va desde el ánodo con un pH bajo, hasta el cátodo con un pH alto y los distintos componentes de la muestra se desplazan hasta encontrar un pH igual a su pI, punto en el cual al tener carga nula dejan de moverse y a éste fenómeno se le denomina enfoque. Los analitos de la muestra una vez enfocados ocupan zonas del capilar muy estrechas lo que confiere al procedimiento una
gran eficacia al oponerse el enfoque a la difusión molecular de las zonas. Una vez separados hay que moverlos, para lo cual se pueden emplear diferentes procedimientos y
llevarlos al detector, donde son detectados y cuantificados.
Se puede realizar de dos formas dependiendo del capilar empleado. Si se elimina totalmente el EOF, el proceso requiere un protocolo en dos pasos, un paso de enfoque seguido de una movilización que se lleva a cabo cuando el enfoque ha finalizado para
forzar a las bandas enfocadas y quietas a pasar por el detector.Si se emplea un capilar con
un recubrimiento dinámico que permite eliminar parcialmente el EOF, la focalización tiene lugar mientras todo el gradiente de pH y el tren de bandas se está moviendo hasta el punto de detección, es decir, se realiza en un solo paso.
Isotacoforesis capilar (CITP)
La CITP se lleva a cabo en un tampón discontinuo y sin EOF. Se basa en el empleo de dos electrolitos con distinta conductividad eléctrica, un electrolito frontal (con una movilidad electroforética mayor a la del analito más rápido de la muestra) y un electrolito terminal (con una movilidad electroforética menor a la del analito más lento de la muestra). La muestra se inyecta entre estos dos electrolitos en lo que se conoce como
formato “sandwich”. Al aplicar el campo eléctrico, se crea un gradiente de potencial a lo
largo del capilar y los analitos se distribuyen en zonas o bandas contiguas en función de sus movilidades electroforéticas y se desplazan entre ambos tampones de diferente conductividad eléctrica a la misma velocidad [117]. Hoy en día la CITP se emplea más como técnica de preconcentración que como técnica de separación. En este modo de CE no se pueden separar de forma simultánea cationes y aniones.
Electroforesis capilar en medio no acuoso (NACE)
En este modo de CE se emplean disolventes no acuosos como disoluciones electrolíticas. La separación en NACE se puede llevar a cabo solamente si los analitos
están cargados o pueden adquirir carga por interacción con un aditivo cargado. La elección del medio no acuoso depende de las características fisicoquímicas de las sustancias a separar y de su interacción con los posibles aditivos. Este modo de separación es especialmente útil para separar compuestos que presentan una baja solubilidad en agua o bien, grupos de analitos que poseen movilidades electroforéticas muy similares en medios acuosos.
Cromatografía electrocinética (EKC)
La EKC constituye una modalidad de trabajo de la CE que fue definida por Terabe en
1989 como: un método de separación analítico que emplea la técnica experimental de la CZE en
combinación con los principios de separación básicos de la cromatografía [118]. Así, en EKC además del tampón de separación empleado en CZE (fase acuosa), se añade un componente denominado “pseudofase” que origina la existencia de un fenómeno cromatográfico al existir dos fases, la fase acuosa y la pseudofase. El fenómeno electrocinético, que incluye tanto la electroforesis como la electroósmosis, provoca el transporte de la pseudofase y de los analitos dentro del capilar. En EKC los solutos pueden interaccionar en mayor o menor medida con la pseudofase, dando lugar a un fenómeno cromatográfico e incluso habrá solutos que no interaccionen con la misma, en cuyo caso su movilidad se deberá al fenómeno electrocinético.
Los modos de separación en EKC pueden clasificarse según la naturaleza de la pseudofase empleada y se nombran de manera general añadiendo el nombre de la pseudofase al término EKC. Entre las pseudofases más empleadas se encuentran las peudofases micelares (MEKC) [119], las ciclodextrinas (CD-EKC) [120] y las microemulsiones (MEEKC) [121], aunque también se han empleado otras pseudofases como proteínas [122], polisacáridos [123], dendrimeros [124], antibióticos macrocíclicos [125], vesículas [5], iones poliméricos, etc. Además y para algunas separaciones especiales se pueden emplear mezclas de las mismas, como es por ejemplo el caso de la separación de compuestos de muy elevada hidrofobicidad, muy relacionados estructuralmente y/o
quirales donde es muy habitual emplear de manera conjunta CDs y micelas (CD-MEKC) [126].
Decir, que aunque inicialmente la EKC se desarrolló para ampliar el campo de aplicación de la CE a la separación de compuestos neutros, hoy en día también se emplea para la separación de compuestos cargados obteniéndose algunas separaciones que en ocasiones, no es posible conseguir utilizando CZE y para la separación de compuestos quirales, siempre que al menos una de las pseudofases empleadas sea quiral [127].
En este trabajo de investigación se han empleado los modos de separación de CD-EKC y CD-MEKC para la separación quiral y no quiral de los compuestos de interés por lo que estos dos modos se describen a continuación.
CD-EKC
Las CDs son los selectores quirales más habitualmente utilizadas en EKC. Hasta Enero de 2004 su uso suponía el 84% de todos los trabajos publicados referentes a separaciones quirales por esta técnica [20]. Son oligosacáridos cíclicos constituidos por varias unidades
de D(+)-glucopiranosa. Tienen forma de cono anular truncado de extremos abiertos, con
una cavidad interna relativamente hidrófoba, determinada por el número de unidades de
glucopiranosa (Figura I.19 a) y un exterior o superficie hidrofílica (incluso iónica en el
caso de algunos derivados de las CDs nativas) debido a la presencia de grupos hidroxilos en las posiciones 2, 3, y 6 del anillo de la glucopiranosa. Aunque hoy en día existen en el mercado una gran variedad de CDs aniónicas, neutras y catiónicas disponibles para su
uso en CE, las tres CDs nativas neutras son la α, β y CDs que tienen 6, 7 y 8 unidades de
glucopiranosa, respectivamente y que se caracterizan por tener la misma profundidad y
diferente diámetro interno, siendo la -CD la más empleada. El mecanismo más aceptado
para la enantioseparación de un analito quiral con las CDs, se basa en la formación de complejos de inclusión en los que el analito quiral (molécula “guest”) es incluido en el interior de la CD (molécula “host”), se establecen enlaces con los grupos hidroxilo
secundarios y se forma el denominado complejo de inclusión “host-guest”, el cual está
representado en la Figura I.19 b [128]. Sin embargo, la formación de esos complejos de
inclusión no es siempre un requisito para la enantioseparación, ya que una inclusión parcial o interacciones intermoleculares externas pueden ser suficientes para la resolución enantiomérica de un analito quiral [128].
Figura I.19. a) Estructura general de una CD. b) Complejo de inclusión de la CD (“host”) y la molécula (“guest”).
La Figura I.20.a muestra a modo de ejemplo, el principio de separación en CD-EKC para un compuesto quiral neutro, en presencia de una CD aniónica empleando un voltaje de separación positivo. En esta situación, la CD aniónica migrará hacia el ánodo y se podrá detectar en el cátodo siempre que el EOF sea mayor que su movilidad electroforética en sentido contrario. Los solutos neutros que no interaccionen con la CD migrarán a la misma velocidad que el EOF y originarán un pico a un tiempo de migración
t0. Los solutos que interaccionen parcialmente con la CD se desplazarán hacia el detector a
una velocidad inferior a la del EOF, pero podrán ser detectados siempre y cuando la movilidad de la CD en sentido anódico sea inferior al EOF en sentido catódico.
Finalmente, los solutos que se incorporen totalmente a la CD migrarán en último lugar.
De este modo, un analito quiral neutro, que tenga dos enantiómeros N1 y N2, que
interaccionen con las CDs de forma enantioselectiva, experimentará un reparto diferencial
entre las fases acuosa y la CD y originará dos picos a distintos tiempos de migración, tN1 y
tN2, obteniéndose un electroforegrama similar al que se muestra en la Figura I.20.b. Indicar
que este es un caso particular de separación en CD-EKC de manera que dependiendo de la naturaleza del analito quiral, de la CD y de las condiciones experimentales se podrían tener muy diferentes situaciones.
Ánodo
Cátodo
Figura I.20. a) Representación del principio de separación en el modo CD-EKC para un analito quiral neutro en presencia de una CD aniónica empleando un voltaje de separación positivo. b) Electroforegrama teórico que se obtendría para un analito quiral
con un centro estereogénico en las condiciones citadas en a). a)
b)
CD-MEKC
En el caso de la separación de compuestos quirales o no quirales muy hidrófobos, que tienden a incorporarse totalmente en la pseudofase, no existiendo selectividad de separación y/o relacionados estructuralmente, que interaccionan de forma similar con la pseudofase eluyendo a un mismo tiempo de migración, puede ser necesario añadir al tampón de separación una segunda pseudofase. El modo de trabajo de CE más empleado en estos casos es CD-MEKC que implica el empleo de CDs y micelas (quirales o no quirales).
Como ya se ha mencionado, las micelas son agregados que se forman por la adición de tensioactivos al tampón de separación cuando éstos se encuentran por encima de su CMC. Estas micelas en disolución acuosa adoptan una estructura esférica, con una parte externa
hidrofílica y otra parte interna hidrofóbica (Figura I.21).
Figura I.21. Esquema de una micela.
Existen una gran variedad de tensioactivos que forman micelas en disolución acuosa y que pueden ser empleados en EKC, siendo el dodecil sulfato sódico (SDS) uno de los que goza de mayor popularidad, debido fundamentalmente a su elevado poder de solubilización. También se han empleado mucho las sales biliares, que son tensioactivos biológicos quirales que presentan la ventaja adicional de poder ser utilizadas como selectores quirales, bien solas o en combinación con CDs [129].
La Figura I.22.a muestra a modo de ejemplo, el principio de separación en CD-MEKC para un compuesto quiral neutro, en presencia de una micela quiral aniónica y una CD neutra. La CD neutra migra hacia el detector a la misma velocidad que el EOF. La micela aniónica migra hacia el ánodo y podrá ser detectada en el cátodo siempre que el EOF sea mayor que su movilidad electroforética en sentido contrario. Los solutos que no interaccionen ni con la micela, ni con la CD migrarán a la misma velocidad que el EOF y
originarán un pico a un tiempo de migración t0. Los solutos que se incorporen totalmente
al sistema micelar y que no interaccionen con las CDs darán lugar a un pico a un tiempo
de migración tm. Un soluto quiral neutro que tiene dos enantiómeros N1 y N2, que
interaccionen con la CD y/o con la micela quiral de forma enantioselectiva experimentarán un reparto diferencial entre las fases acuosa, micelar y las CDs, dando
lugar a dos picos a distinto tiempo de migración (tN1 y tN2) entre t0 y tm y obteniéndose un
electroforegrama similar al que aparece en la Figura I.22.b. En el caso particular de que el
compuesto no sea quiral, éste interaccionará con la CD y con la micela pero de forma no estereoselectiva y experimentará un reparto diferencial entre las tres fases, originando un único pico a un tiempo de migración determinado. La selectividad de separación en estos sistemas se modificará cambiando el tipo y concentración de CD y/o tensioactivo. Hay que indicar que este es un caso particular de separación en CD-MEKC, de manera que dependiendo de la naturaleza del analito, la CD y la micela se podrán tener muy diferentes situaciones.