Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)

Para determinar la diversidad microbiana en distintos ecosistemas y supervisar el comportamiento microbiano de la comunidad en un cierto período de tiempo, se han desarrollado varias herramientas que permiten obtener un “perfil genético” o “huella genética” (fingerprinting) de la comunidad microbiana (Muyzer, 1999).

Entre los métodos de “huella genética” más utilizados podemos mencionar la técnica de “electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante” (DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) (Muyzer y col., 1993 y 1998). Esta técnica fue inicialmente publicada por Fischer y Lerman en 1979 para detectar mutaciones genéticas y separar fragmentos de ADN del mismo tamaño pero de distinta secuencia de nucleótidos.

La técnica de DGGE ha sido ampliamente utilizada en ecología microbiana (Niederberger y col., 2009; Buesing y col., 2009). En particular esta técnica se basa en la disminución de la velocidad electroforética de las moléculas de ADN de doble cadena cuando se encuentran parcialmente desnaturalizadas, debido a cambios en la estructura de la molécula que afectan su movilidad cuando migran en un gel que contienen un gradiente lineal desnaturalizante del ADN.

La técnica de DGGE se basa en las propiedades de fusión del ADN de doble cadena, de manera que una molécula de ADN se desnaturalizará en regiones discretas llamadas dominios o puntos de fusión (melting point) en un gel de poliacrilamida que posee un gradiente desnaturalizante generado a partir de una concentración adecuada de formamida y urea. Cada punto se desnaturaliza a una temperatura (temperatura de fusión o Tm) en la que cada par de bases de ADN (dúplex) está en un equilibrio entre el estado helicoidal y el desnaturalizado.

Debido a que las interacciones entre bases adyacentes tienen una influencia significativa en la estabilidad de la doble hélice, se alcanzará un punto donde la concentración de agente desnaturalizante iguale a la Tm de su dominio de menor temperatura de fusión, causando una desnaturalización parcial y consecuentemente un marcado retraso en su movilidad electroforética (Muyzer y Smalla, 1998).

Cuando la electroforesis de una mezcla de fragmentos de ADN amplificados con cebadores universales mediante PCR, a partir de ADN total extraído de una muestra ambiental, se realiza en condiciones adecuadas en geles de poliacrilamida bajo un gradiente lineal de desnaturalización, las moléculas de ADN con distinta secuencia se desnaturalizan parcialmente a distintas alturas del gradiente (Figura 3) y por lo tanto, se detienen en su migración electroforética en distintas posiciones en el gel (Muyzer y Smalla, 1998; Muyzer, 1999).

Figura 3. Esquema de la aplicación de la técnica de DGGE para el estudio de la biodiversidad microbiana de los ecosistemas

De esta forma se obtienen perfiles de bandas que se corresponden con el número de miembros predominantes en la comunidad microbiana. Una vez separadas, las bandas correspondientes a distintas secuencias de ADN pueden reamplificarse con los mismos cebadores y ser secuenciadas, permitiendo la comparación de las nuevas secuencias con las ya depositadas en las bases de datos, siendo posible establecer su afiliación taxonómica. La técnica de DGGE representa uno de los métodos de elección para el análisis de mutaciones de ADN de doble cadena y ha sido empleado en un amplio espectro de aplicaciones.

Entre las ventajas del DGGE se encuentran la gran sensibilidad de detección de mutaciones (90%) y la posibilidad de investigar la diversidad de una población microbiana natural sin necesidad de aislar y estudiar individualmente sus componentes.

El DGGE permite el análisis simultáneo de las muestras múltiples que permiten seguir cambios de la comunidad en un cierto plazo, y también permite la comparación de los perfiles de biodiversidad de la población, evaluando diferencias espaciales y temporales en un determinado nicho ecológico. Hoy en día se considera una técnica de elección para la caracterización de poblaciones naturales, en las que un porcentaje alto de los microorganismos presentes pueden ser no cultivables (Muyzer, 1999). Por otra parte, esta

Cola GC Cola GC Fragmentos de PCR Fragmentos de PCR desnaturalizados Muestras de comunidades microbianas

Extracción de ADN de cada comunidad Reacción de PCR G ra d ie n te d es n a tu ra li za n te − +

Cada carril de DGGE representa una comunidad microbiana

S ep a ra ci ó n d e lo s fr a g m en to s d e P C R

Fragmentos compartiendo el mismo gen

técnica ha resultado particularmente útil para la identificación de los miembros dominantes en la comunidad (Lindström y Leskinen, 2002).

Sin embargo, la técnica de DGGE presenta varias desventajas. La primera de ellas está relacionada con los errores introducidos por los procedimientos de la extracción del ADN total de la muestra y su posterior amplificación por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) (Suzuki y Giovannoni 1996; Wintzingerode y col., 1997; Crosby y Criddle, 2003) ya que son los principales procedimientos en que se basa la técnica de DGGE.

Se estima que la técnica de DGGE sólo puede detectar entre 1 y 2% de las especies totales de una comunidad, es decir, sólo las especies dominantes (MacNaughton y col., 1999; Muyzer, 1999). Además, los distintos fragmentos de ADN que difieren en su secuencia pueden presentar características similares de movilidad dentro del gel de poliacrilamida, por tanto, los diferentes fragmentos migran juntos, dificultando la diferenciación (Gelsomino y col., 1999). Por otro lado, una misma especie puede llegar a generar más de una banda en el perfil de DGGE debido a la existencia de múltiples copias del gen del ARNr 16S que difieren ligeramente en sus secuencias (Gelsomino y col., 1999; Niemi y col., 2001).

Otro inconveniente es la limitación relativa al tamaño máximo de los fragmentos a separar (500pb). La opción inicial se basa en la amplificación de fragmentos del gen del ARNr 16S y específicamente la región hipervariable V1-V3 diseñando parejas de cebadores universales (Heuer y col., 1997).

Por lo tanto el empleo de estos cebadores universales para el análisis del gen del ARNr 16S tiene una gran limitación en caso de muestras con elevada diversidad, siendo muy difícil el aislamiento de bandas individuales para su reamplificación y secuenciación (Muyzer y Smalla, 1998). Sin embargo y en numerosos casos, se han diseñado parejas de cebadores para la amplificación selectiva de fragmentos del gen del ARNr 16S de distintos grupos microbianos como por ejemplo: Cyanobacteria (Nubel y col., 1997); bacterias oxidadoras de amonio (Kowalchuk y col., 1997); Agrobacterium-Rhizobium (Muyzer y Smalla, 1998); actinomicetos (Heuer y col., 1997) y bacterias reductoras de sulfato (Teske y col., 1996). Igualmente empleando genes funcionales como base del estudio de la biodiversidad, el DGGE proporciona patrones de diversidad genética para el gen funcional estudiado, permitiendo el análisis de actividades determinadas de comunidades específicas.

Este tipo de investigación ha facilitado la discriminación entre microorganismos filogenéticamente cercanos pero con diferentes papeles ecológicos (Muyzer, 1999; Muyzer y Smalla, 1998). Por ejemplo se han podido diferenciar reductores de sulfato, mediante amplificación de fragmentos del gen codificante de la enzima hidrogenasa [NiFe] (Wawer y col., 1997); degradadores de fenol, mediante amplificación del gen que codificante de la enzima fenol-hidrolasas [LmPH] (Watanabe y col., 1998) y oxidadores de amonio, mediante

amplificación del gen amoA codificante de la enzima amonio-monooxigenasa (Rotthauwe y col., 1997).

II. 2. Hibridación in situ de fluorescencia con un sistema de