Electroforesis SDS-PAGE.

La electroforesis en geles desnaturalizantes de acrilamida con SDS es un sistema clásico de separación de proteínas en función de su peso molecular. El método se basa en que las proteínas contenidas en una solución de SDS (detergente aniónico) son capaces de migrar bajo un campo eléctrico. El SDS contenido en el tampón de carga de las muestras confiere a las proteínas una carga negativa, manteniendo la relación carga/masa constante. Si se someten dichas preparaciones a un campo eléctrico establecido sobre una malla de polímero de acrilamida/bisacrilamida, las proteínas migrarán

desde un polo negativo hacia un polo positivo en función de su peso molecular. En este tipo de electroforesis, se preparan dos tipos de geles: un gel concentrador, cuya función consiste en alinear las proteínas antes de llegar a cabo la separación de éstas, y un gel separador, que, como su nombre indica, separa las proteínas según su peso molecular. La concentración de acrilamida del gel separador dependerá del tamaño de la proteína que se va a someter a migración. Así, la separación de proteínas con un peso molecular menor será más eficiente en geles más concentrados, y viceversa. Junto con las muestras problema, se hacen migrar estándars de peso molecular conocido y preteñidos, como marcadores para conocer el tamaño de la proteína problema.

MATERIALES

- Extractos de proteína total a partir de células o de tejidos en tampón de carga.

- Sistema Mini-Protean (BioRad).

- Fuentes de corriente eléctrica. - Pipeta Hamilton de 50 μl. REACTIVOS

- Tampón de electroforesis 10X (Tris base 250 mM, glicina 1.92 M, SDS 1%). Se usa a 1X.

- Tampón de carga de las muestras LSB 4X (Para 40 ml: 8 ml Tris-HCl 2M, pH 6.8; 32 ml glicerol; 3,2 g SDS; 160 μl de azul de bromofenol). Se usa a 1X.

- Acrilamida/Bisacrilamida 40% (BioRad). - APS (Persulfato de amonio 10% en agua). - TEMED.

- Solución gel separador (1,5 M Tris HCl, pH 8.8, 0.1% SDS). - Solución gel concentrador (0,5 M Tris HCl, pH 6.8, 0.1% SDS). - DTT o β-mercaptoetanol.

- Estándars de peso molecular preteñidos (BioRad o Fermentas). METODOLOGÍA

1. Preparación de las muestras. La mezcla se realiza siempre en contacto con hielo (4oC). En un tubo eppendorf se deposita la cantidad de proteína deseada (entre 1 y 100 μg por muestra), a la que se añade el tampón de carga LSB para que quede a una concentración final de 1X. Cuando las muestras se preparan en condiciones reductoras, se añade DTT a una concentración final de 100 mM o 5% de β-mercaptoetanol. Las muestras se calientan en un termo- agitador y la temperatura dependerá del tipo de proteína a inmunodetectar. Para proteínas de membrana, las muestras se procesan a 60oC durante 2 - 5 minutos para evitar que se formen agregados. En cambio, para proteínas citosólicas, las muestras se procesan a 95oC durante 5 minutos. Se da un spin a las muestras y ya están listas para ser cargadas en el sistema de electroforesis.

2. Polimerización del gel. Previamente al montaje del sistema de electroforesis, se lavan con etanol todas las piezas que estarán en contacto con las proteínas. El sistema se monta según las indicaciones del fabricante. El APS y el TEMED son los últimos reactivos que se mezcla en la solución del gel separador. En la siguiente tabla se muestran las relaciones de los distintos reactivos para los diferentes porcentajes de los geles de acrilamida.

Se mezcla ligeramente por inversión y se deposita lentamente entre los dos vidrios del sistema, con una pipeta Pasteur, con la precaución de que no se formen burbujas. El gel separador deberá ocupar aproximadamente las 3/4 partes inferiores del sistema. Antes de su polimerización, se añade lentamente una capa de isopropanol en la parte superior del gel para permitir que el límite superior del gel quede recto. Una vez polimerizado el gel separador, se decanta el isopropanol, se lava con agua y se deposita el gel concentrador. Rápidamente se coloca el peine, antes de que se produzca la polimerización del gel concentrador. A continuación se monta el sistema de vidrios con los geles polimerizados en la cubeta de electroforesis, que se llena de solución de electroforesis 1X, de manera que haya una continuidad eléctrica.

3. Migración del gel. Se extrae el peine y se cargan las muestras con una pipeta Hamilton de 50 μl. Se cierra el circuito con la tapa de la cubeta y se conecta a una fuente de alimentación a una corriente constante de 100-140 V, hasta que el marcador de peso molecular se haya separado lo suficiente como para poder detectar la proteína de interés.

2.2.2 Transferencia.

Una vez terminada la separación electroforética, las proteínas se electro- transfieren a una membrana porosa de fluoruro de polivinilido (PVDF), de manera que queden inmovilizadas, permitiendo su posterior inmunodetección. MATERIALES

- Cubeta de transferencia, con los casetes de transferencia correspondientes y esponjas (Sistema de Western-Blot MiniProtean de BioRad).

medida que el gel separador).

- Membrana Immobilon-P (Millipore) (un rectángulo de membrana de transferencia por cada gel, del mismo tamaño que el gel separador). REACTIVOS

- Tampón de transferencia 10X (250 mM Tris base, 1,92 M glicina, pH 8.3). Se usa a 1X + 20% metanol. El mismo tampón se utiliza para el montaje de los casetes.

- Agua destilada. - Metanol.

METODOLOGÍA

Todo el proceso debe llevarse a cabo con guantes.

1. Primero, se procede a hidratar la membrana de manera que sea receptiva a inmovilizar proteínas. Para ello, se sumerge la membrana en una cubeta con metanol absoluto durante 5 minutos, y a continuación, en otra cubeta con agua destilada durante otros 5 minutos. Finalmente se deja equilibrar en el tampón de transferencia.

2. Los casetes de transferencia, las esponjas, y los papeles Whatmann se sumergen en tampón de transferencia durante unos minutos. Se coloca el casete abierto con la cara oscura al fondo. A continuación, sobre la cara oscura, se coloca una de las esponjas, un papel Whatmann y el gel separador (al que previamente se le ha extraído el concentrador), por este orden. Posteriormente se coloca la membrana de manera que no se formen burbujas entre el gel y la membrana, ya que la formación de burbujas impide la transferencia proteica. Sobre la membrana se coloca el otro papel Whatmann y otra esponja, y se procede a cerrar el sándwich. Esta disposición permite un

flujo del tampón siguiendo el campo eléctrico desde el gel hacia la membrana, transfiriendo las proteínas inmovilizadas en el gel en dicha membrana.

3. El casete de transferencia se coloca en la cubeta, previamente cubierta con tampón de transferencia, de forma que la cara oscura coincida con el polo negativo, ya que las proteínas se transferirán en esa dirección. También se deposita una placa de hielo para evitar el sobre-calentamiento del sistema. El tiempo de transferencia depende del tamaño de la proteína; así, cuanto mayor es el peso molecular de ésta, mayor tiempo de transferencia es necesario aplicar. Generalmente se ha aplicado 280 mA durante 100 minutos o toda la noche a 35 V en frío.

2.2.3 Inmunodetección.

Una vez realizada la transferencia se procede a la detección de la proteína de estudio inmovilizada sobre la membrana, mediante anticuerpos específicos. Durante este trabajo se han realizado WBs contra diferentes proteínas utilizando anticuerpos policlonales y monoclonales que se describirán en cada uno de los apartados de resultados.

MATERIALES Y REACTIVOS

- Solución de Pounceau (ácido acético 5% en agua + 0,1% pounceau). - Solución de bloqueo (5% de leche en polvo en TTBS 1X).

- Anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo.

- Anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano (diluidos 1/10000 en solución de bloqueo).

- Solución de lavado: TTBS 1X (TBS 1X, 0.1% Tritón X-100). - Reactivo ECL para el revelado (ver apéndice de soluciones). - Hiperfilms (Amersham) y casete de revelado.

METODOLOGÍA

1. Las membranas de la transeferencia son depositadas en una cubeta con solución de Pounceau, la cual teñirá las proteínas. Así se puede comprobar que la transferencia ha funcionado bien. Se puede observar si han quedado o no burbujas. La membrana se destiñe con la misma solución de transferencia. 2. Bloqueo de la membrana. Es necesario bloquear la membrana para evitar interacciones inespecíficas de los anticuerpos a las proteínas electro- transferidas. Para ello, se preincuba la membrana con una solución rica en proteínas (leche, en este caso), que se unirá a los lugares de interacción inespecífica. Para ello, se incuba la membrana en solución de bloqueo durante 60 minutos en agitación suave a temperatura ambiente.

3. Incubación con anticuerpo primario. El anticuerpo primario debe diluirse igualmente en solución de bloqueo, de forma que se establezca una cierta competencia entre las proteínas de la leche (uniones inespecíficas) y el anticuerpo (uniones específicas), de modo que el anticuerpo no tenga otra posibilidad que unirse a su proteína específica contra la que está dirigido. La incubación se lleva a cabo en una bolsa de plástico Glad sellada, que contiene la membrana bloqueada y la solución de incubación con el anticuerpo primario (1-3 ml) y se mantiene en agitación suave durante 60 minutos a temperatura ambiente o durante 16 horas a 4oC.

4. Lavado. Con el fin de retirar el exceso de anticuerpo primario de la superficie de la membrana, se efectúan 3 lavados de 10 minutos cada uno, con la solución de lavado en agitación suave, a temperatura ambiente.

5. Incubación con anticuerpo secundario. Para detectar las uniones específicas del anticuerpo primario con la proteína de estudio, la membrana se

incuba con anticuerpos especie-específicas para inmunoglobulinas G (IgGs), conjugados con la enzima peroxidada. Esto permite detectar la interacción mediante una reacción hidrolítica que genera luz. El anticuerpo secundario se diluye también en solución de bloqueo (1:10000) y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. Posteriormente, se vuelven a efectuar 3 lavados de 10 minutos y en agitación con la solución de lavado.

6. Revelado. El revelado se hace incubando la membrana con una solución que contiene luminol, compuesto que al ser hidrolizado por la peroxidada genera luz. Esta luz se detecta mediante la exposición de la membrana sobre un film fotográfico. Se incuba la membrana con la solución de ECL durante 1 minuto y se retira el exceso. El revelado se lleva a cabo en una cámara oscura con la ayuda de un casete de revelado, efectuando exposiciones a diferentes tiempos sobre el papel fotográfico hiperfilm de alta sensibilidad. Los films se revelan con un sistema de revelado fotográfico.