Las proteínas COX-2, tau-P, APP, BACE1 y nicastrina, se evaluaron por análisis de electroforesis y Western Blot, utilizando anticuerpos específicos para cada una: COX-2 (SC376861), tau-P (SC101813), APP (SC28365), BACE1 (SC33711) y Nicastrina (SC25648). Como control se utilizó GAPDH (SC25778). La técnica se detalla a continuación.
8.4.1 Extracción de proteínas totales.
Se agregaron 500 μl de PBS frío a cada uno de los pozos para lavar las células del medio de cultivo, posteriormente se añadieron 200 μl del buffer de lisis (stock: NP-40 al 1%, Glicerol al 10%, NaCl 137 mM, Tris-HCl 20mM pH=8, H2O,
inhibidor de proteasas), se incubó durante diez min a 25ºC con agitación suave y se desprendió la monocapa mediante raspado mecánico con espátula (Scraping). Posteriormente, se recolectaron las células desprendidas y suspendidas en un tubo Eppendor de 1.5 ml, se centrifugaron durante 5 min a 14,000 rpm a 4°C. Se colectó el sobrenadante y se almacenó a menos 20°C hasta su uso.
8.4.2 Cuantificación de proteínas por el método de Bradford.
Para cuantificar la cantidad de proteínas obtenidas del paso anterior, se realizó la curva estándar como se muestra en la Tabla 1:
#Tubo Volumen del estándar (μl) Fuente del estándar Volumen del diluyente (μl) Concentración final (μg/ml) 1 20 2mg/ml stock 0 2000 2 30 2mg/ml stock 10 1500 3 20 2mg/ml stock 20 1000 4 20 tubo 2 20 750 5 20 tubo 3 20 500 6 20 tubo 5 20 250 7 20 tubo 6 20 125 8 20 agua 20 0
Tabla 1. Preparación de la curva de cuantificación de proteínas.
Los tubos se marcaron del 1 al 8 y en los volúmenes indicados. Para conseguir su respectiva concentración se inició con la albumina de suero bovino en una concentración de 2 mg/ml, la cual se fue diluyendo con PBS hasta lograr las concentraciones necesarias para la curva y poder cuantificar las proteínas.
Se colocaron 10 μl de la muestra a cuantificar por pozo de la microplaca, se usaron tres pozos por muestra. Se adicionaron 250 μl de reactivo de Bradford y finalmente se colocaron en el lector de microplacas y se leyeron a una absorbancia de 595 nm. Utilizando las absorbancias de la curva patrón, se obtuvo por medio de una regresión lineal (Correlación de r2 = 0.95 a 1.00) las concentraciones de las muestras problemas. Los resultados se reportaron en μg/μl.
8.4.3 Electroforesis.
Con las concentraciones conocidas, se determinó una curva de concentración de proteínas: primero se diluyó a un volumen final de 10 μl con PBS para cada muestra y se adicionó buffer de muestra a una dilución 1:4. Para desnaturalizar las proteínas, las muestras se colocaron en baño María a 90 °C por 5 min.
Por otro lado, se prepararon los geles de acuerdo con la Tabla 2 y se montaron en la cámara de electroforesis de la marca Bio Rad. Después, se colocaron los geles en el tanque del sistema. Tomando en cuenta el instructivo del equipo disponible se llenó la cámara con buffer de corrida (25mM Tris, 190mM glicina, 0.1% SDS). Se cargaron las muestras en cada uno de los pozos tomando el volumen correspondiente a la concentración deseada. En el primer carril se cargó un μl del marcador de peso molecular. Se colocó la tapa y se conectó a la fuente de poder a 100 V por 15 min para empaquetar las proteínas y posteriormente 130 V por 90 min, aproximadamente. El corrimiento terminó cuando el frente de corrida se encontró aproximadamente a 1 cm del final.
Gel de resolución al 10% Gel de empaquetamiento al 4%
ddH2O 5.9 ml ddH2O 2.4 ml Tris 8.8 ph 7.5 ml Tris 6.8 ph 1ml Acrilamida 6.6 ml Acrilamida 600 ml SDS 200 μl SDS 40 μl APS 80-160 μl APS 35-50 μl TEMED 30-60 μl TEMED 15-20 μl
Tabla 2. Concentraciones para la elaboración de geles de acrilamida.
En la tabla se observan los distintos volúmenes y reactivos para la elaboración de los geles de acrilamida de resolución y empaquetamiento. Este volumen es suficiente para preparar dos geles, los cuales se trabajaron al mismo tiempo.
8.4.4 Inmunotransferencia.
Entre 15 y 20 min antes de que terminara la electroforesis, se mantuvieron las membranas de PVDF en metanol. Una vez terminada la electroforesis, se sacaron los geles de la cámara y se colocaron en la cámara de transferencia de la siguiente manera: esponja, filtro, gel, membrana, filtro, esponja. Luego, se colocó en la cámara de transferencia, se le adicionó el buffer de transferencia (25mM Tris, 190 mM glicina, 20% metanol, 0.1% SDS) y un recipiente con hielo. La transferencia se realizó a 100V por 2 h.
8.4.5 Incubación y revelado.
Una vez terminada la transferencia, se sacaron las membranas y se colocaron en un recipiente. Se hicieron tres lavados con TBS-Tween-1X. Para saber si las proteínas se transfirieron a la membrana, se preparó rojo de Ponseau al 1%, y se adicionó a las membranas. Si las proteínas se transfirieron, se debe observar una serie de bandas teñidas de rojo en la membrana. Luego, se lavaron las membranas con TBS- Tween-1X para eliminar el exceso de rojo de Ponseau y se incubaron con leche al 5% en TBS-Tween-1X durante 1 h, para bloquear los sitios inespecíficos. Terminado este tiempo, se hicieron tres lavados con TBS- Tween-1X, (10 min) y se incubaron con el Ac 1° (APP: sc28365, BACE1: sc33711, tau-P: sc101813 y COX-2: sc376861 a una dilución 1:500 para cada anticuerpo; nicastrina: sc25648 con una dilución 1/1000) durante toda la noche (18 h) a 4°C. Al día siguiente, se recuperó el Ac 1° y se guardó a 4°C. Se hicieron tres lavados con TBS-Tween-1x, y se dejó incubando con el Ac 2° (anti-mouse a una dilución 1:500 dirigido contra APP, BACE 1, y COX-2; anti-rabbit a una dilución 1:1000 dirigido contra tau fosforilada y Nicastrina, ambos de la marca Santa Cruz), durante 1 h a temperatura ambiente. Terminado este tiempo, se hicieron tres lavados con TBS-Tween-1X, y se reveló con un kit para fosfatasa alcalina (1-step NBT/BCIP; catálogo: 34042) de la marca Thermofisher. La reacción se detuvo agregando TBS-Tween-1X.