2.2.1 Geräte und Materia
- 80 oC Gefr
Autoklav (Tuttnauer 3850 EL) B
CO2-Inkubator (Hera cel
dH2O Anlage (Milli-Q academic) Millipore
Einfriergefäße (Qualifreeze) Qualilab inwegpipetten ste
E E
Kryoröhrchen steril Nunc
Poly–L–Lysin
PBS-Puffer (steril):
140 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,75 mM KH2PO4, pH 7,4 mit HCl eingestellt in dH2O
Die fertige Lösung wurde bei 120 °C und 1,2 bar für 20 min autoklaviert.
100 µg/ml steriles Poly-L-Lysin (Sigma) in sterilem PBS-Puffer
Kulturschalen oder ster Poly–L–Lysin Lösung:
ilisierte Deckgläschen wurden vollständig mit Poly-L-Lysin Lösung edeckt und 1 h bei 37 oC im CO2-Inkubator inkubiert. Anschließend wurde 3 mal mit
sterilem PBS-Puffer gewaschen und, falls Kulturschalen oder Deckgläschen nicht
gl. 2.2.2.
s’ B.S.S. (Gibco Invitrogen Corporation)
m) High Glucose (PAA) supplementiert mit 2 mM L-Glutamin (Invitrogen), 10 % fötales Kälberserum (FCS; PAA), 50 U/ml Penizillin (Invitrogen) und 50µg/ml
t den entsprechenden Antibiotik Life Technologies) in
bryonic kidney 293) wurde von der Firma ATTC, ie Kultivierung der Zellen erfolgte nach Standardprotokollen (Kruse and Patterson, 1973).
b
unmittelbar verwendet wurden, 1 mal mit dH2O (steril) nachgewaschen.
2.2.3 Kultivierung der HEK293 Zellen
2.2.3.1 Medien und Lösungen
PBS-Puffer (steril): v
Trypsin–EDTA-Lösung:
0,05 % Trypsin, 0,53 mM EDTA*4Na in Hank Grundmedium:
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s Mediu Streptomyzin (Invitrogen). Selektionsmedien: Grundmedium supplementiert mi enden Endkonzent a (Invitrogen folg rationen: l • Genetizin (G 418): 200 µg/m • Zeozin: 200 µg/ml • Hygromyzin: 150 µg/ml
2.2.3.2 Durchführung
Die Zelllinie HEK293 (human em Rockville (USA) bezogen.
2.2.4 Anlegen von Dauerkulturen (Kryokonservierung)
ermedium: Einfri
rt mit 5 % Dimethylsulfoxid (DMSO; Roth)
:
Einfriermedium suspendiert und anschließend in ein Kryoröhrchen überführt. Die Kulturen wurden in und nach 1 Woche in flüssigem Stickstoff
von HEK293 Zellen mit rekombinanter DNA
wurden in einer 6 cm Schale bis zu einer Konfluenz von etwa he) gemäß den Herstellers transfiziert. Im Falle einer transienten Transfektion wurden
sfektion in verschiedenen Verdünnungen in das entsprechende vgl. 2.2.3) umgesetzt. Stabile Klone wurden mit Trypsin–Lösung
UNN bo 4 well Platten transferiert. Die Zellen wurden anschließend
pression des exogenen Proteins getestet (vgl. 2.2.6). FCS (PAA) supplementie
PBS-Puffer(steril): vgl. 2.2.2.
Trypsin–EDTA-Lösung vgl. 2.2.3.1.
Zum Anlegen von Dauerkulturen wurden konfluent gewachsene Zellen einer 10 cm Schale mit sterilem PBS-Puffer gewaschen, in 3 ml Trypsin–EDTA-Lösung abgelöst und mit 3 ml Grundmedium (vgl. 2.2.3.1) versetzt. Die Zellen wurden in der Zentrifuge bei RT 5 min und 200 xg sedimentiert. Das Zellsediment wurde in 1 ml frischem
re
Einfriergefäßen über Nacht bei –80 °C gefroren gelagert.
2.2.5 Transfektion
Die entsprechenden Zellen
50 % kultiviert und mittels FuGENETM 6 Transfection Reagenz (Roc Anweisungen des
die Zellen nach 24 h analysiert. Zur Selektion stabiler Einzelzellklone wurden die Zellen 24 – 48 h nach Tran
Selektionsmedium (
(vgl. 2.2.3) unter Verwendung steriler Klonierungszylinder (8 x 8 mm; D La rtechnik) abgelöst und in 2
2.2.6 Nachweis der exogenen Proteinexpression in transfizierten Zellen
40 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,75 mM KH2PO4, pH 7,4 mit HCl eingestellt in dH2O
Selektion erhaltenen Einzelzellklone wurden bis zur Konfluenz in einer 6 cm Puffer gewaschen und mechanisch in 1 ml PBS-Puffer von der chale abgelöst. Die so gewonnen Zellen wurden in einer Tischzentrifuge (vgl. 2.5.1) bei
.2.7 Übersicht über die verwendeten genetisch veränderten Zelllinien
Name Mutterzelllinie exogen exprimierte Resistenz Zitat
t selbst erstellt)
PBS-Puffer: 1
Die nach
Schale kultiviert, mit PBS- S
RT 5 min/ 200 xg pelletiert. Die Membranproteine wurden isoliert (vgl. 2.5.4.2), in 60 µl 2 fach SDS-Probenpuffer (vgl. 2.5.10) resuspendiert und 5 min/ 95 oC/ 1400 upm auf einem Thermoschüttler (vgl. 2.5.1) inkubiert. 1/4 der Probe wurde auf einem SDS-Polyacrylamid Gel getrennt (vgl. 2.5.10.1) und die Proteine im Western Blot nachgewiesen (vgl. 2.5.10.3).
2
Proteine (falls nich
βAPPwt HEK293 βAPP wt 695 G418 (Haass et al., 1992b)
βAPPsw HEK293 βAPP695sw G418 (Citron et al., 1992)
BACE-1 βAPPwt βAPP695wt
BACE-1
G418 Zeozin
BACE-1 S498A βAPPwt βAPP695wt
BACE-1 S498A
G418 Zeozin
BACE-1 S498D βAPPwt βAPP695wt
BACE-1 S498D
G418 Zeozin
BACE-1 ∆C βAPPwt βAPP695wt
BACE-1 ∆C
G418 Zeozin
(Capell et al., 2000)
BACE-2 βAPPwt βAPP695wt
BACE-2 G418 Hygromyzin BACE-1/ BACE-2 BACE-1 βAPP695wt BACE-1 BACE-2 G418 Zeozin Hygromyzin βAPPsw/ BACE-1 βAPPsw βAPP695sw BACE-1 G418 Zeozin PS1wt βAPPsw βAPP695sw PS1wt G418 Zeozin (Steiner et al., 1999c) PS1 D385N βAPPsw βAPP695sw PS1 D385N G418 Zeozin (Steiner et al., 1999c)
Proteine (falls nicht selbst erstellt)
Name Mutterzelllinie exogen exprimierte Resistenz Zitat
695sw G418
Zeozin
von Herrn
Lammich zur Verfügung PS1wt/ ACE-1 PS1wt βAPP B PS1wt BACE-1 Hygromyzin Dr. Sven gestellt PS1 D385N/ BACE-1 PS1 D385N βAPP695sw PS1 D385N BACE-1 G418 Zeozin Hygromyzin
von Herrn Dr. Sven Lammich zur Verfügung gestellt
sBACE-1 βAPPsw βAPP695sw
sBACE-1
G418 Zeozin
(Capell et al., 2000)
Tabelle 5: Zelllinien.
Aufgeführt sind alle im Rahmen dieser Arbeit verwendeten genetisch veränderten Zelllinien. Angegeben ist der Name der jeweiligen Mutterzelllinie, alle exogen exprimierten Proteine (vgl. 2.1.2.1) und die entsprechenden Resistenzen zur Selektion der Einzelzellklone. Falls Zelllinien nicht selbst erstellt wurden ist die entsprechende Referenz angegeben.
2.3.1 Herstellung polyklonaler Antikörper
innung naler wurden synthetische Peptide (Eurogentec), end de n Regi ntiellen rpers, an LH (keyhole limpet
b d das P Immunisierung von Kaninchen verwendet. Die Kopplung der Peptide, die I er K en, sowie die Gewinnung der Antiseren wurde von der Firma E gefü
2.3.2 Übersich die p Antikör
Folg eschrie slos
Maus IgG-Antikörper, während es sich bei den die polyklonalen Antikörpern um n IgG-A r hand