Ensamblaje de las subunidades ribosómicas

El trabajo pionero de los laboratorios de Planta y Warner durante los años 70, permitió la caracterización de un complejo denominado pre-partícula 90S, en la que se consideraba que el pre-rRNA 35S se procesaba a la vez que se iban acoplando las proteínas ribosómicas, el rRNA 5S y factores de ensamblaje (Trapman et al., 1975; Udem y Warner, 1972). Después de producirse el corte en el sitio A2,la pre-partícula 90S se escinde en otras dos, los pre-ribosomas

60S (pre-66S) y 40S (pre-43S), precursores de las subunidades maduras 60S y 40S respectivamente (). Posteriormente, se descubrió que en la mayoría de las ocasiones, el procesamiento en el sitio A2 ocurre co-transcripcionalmente, liberándose inmediatamente las

partículas pre-40S y formándose las partículas pre-60S al ensamblarse las RPs y los factores de ensamblaje de la LSU en los transcritos nacientes 27S pre-rRNA (Osheim et al., 2004; Kos y Tollervey, 2010; Horn et al., 2011). Durante la última década las purificaciones de pre- partículas usando factores de ensamblaje unidos al epítopo TAP (“Tandem affinity

purification”) y el desarrollo de la espectrometría de masas han permitido aislar y analizar la

composición de distintas partículas pre-ribosómicas (Bassler et al., 2001; Harnpicharnchai et

al., 2001; Fatica et al., 2002). Estas aproximaciones han facilitado el ordenamiento de los

eventos de ensamblaje en las rutas de maduración de las subunidades 60S y 40S permitiendo indagar molecularmente los pasos de este proceso tan dinámico (Grandi et al., 2002; Nissan et

al., 2002; Schafer et al., 2003).

a) Pre-partículas ribosómicas 90S

En S. cerevisiae la formación de este precursor inicial denominado “pre-ribosoma 90S” ocurre al asociarse co-transcripcionalmente varias snoRNPs, numerosas RPs y factores de ensamblaje de la subunidad 40S al transcrito primario del rRNA 35S (Dragon et al., 2002). Por el contrario, carece de la mayoría de los factores necesarios para la biosíntesis de la subunidad 60S (Grandi et al., 2002). La formación de estos pre-ribosomas 90S o SSU procesoma (small

subunit processome) ocurre al ensamblarse de una forma jerárquica subcomplejos proteicos pre-

formados (Perez-Fernandez et al., 2007). La composición de estos subcomplejos denominados UTP fue descrita por Krogan et al., 2004, definiéndose posteriormente el orden jerárquico, según el cual la asociación del complejo UTP-A/tUTP con el pre-rRNA es necesaria para el posterior ensamblaje de los complejos snoRNP U3/UTP-B y Rrp5/UTP-C. Este ensamblaje está estrechamente unido a la modificación y el plegamiento del pre-rRNA y posiblemente dirige la compactación del pre-ribosoma 90S (Perez-Fernandez et al. 2011). Muchas de las proteínas que componen el subcomplejo tUTP intervienen no sólo en el procesamiento del pre-rRNA, sino también en la transcripción del rDNA (Gallagher et al., 2004) (Fig. 9).

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Figura 9. Modelo de la formación de la partícula pre-ribosómica 90S. El ensamblaje del subcomplejo tUTP con el

pre-rRNA 35S inicia la asociación jerárquica de los complejos indicados para formar la partícula pre-ribosómica 90S, donde comienza la compactación y el procesamiento del pre-rRNA (Gerhardy et al., 2014).

b) Pre-partículas ribosómicas 40S

La maduración de la subunidad 40S es un proceso relativamente simple que implica sólo a unos pocos factores ribosómicos, los cuales participan principalmente en el exporte núcleo-citoplasma y las etapas finales de maduración (Fig. 10). Tras el procesamiento en el sitio A2 la mayoría de los factores unidos a la partícula 90S son liberados, aunque algunos

permanecen como Enp1, Pno1, Dim1 y Hrr25 y además se asocian otros como Rio2 o Ltv1. Estos factores son necesarios para su exporte al citoplasma y para la incorporación de S3 (Schafer et al., 2003; Gerbasi et al., 2004; Schafer et al., 2006). En estas pre-partículas también se encuentran las snoRNPs U14, snR10 y snR30 que intervienen en la producción del rRNA maduro 18S (Morrisey y Tollervey, 1997; Lemay et al., 2011).

La presencia de la proteína S15 en las partículas pre-40S es necesaria para que sean exportadas al citoplasma. Este transporte está mediado por el factor Xpo1/Crm1 y el heterodímero Mex67-Mtr2 (Segref et al., 1997; Santos-Rosa et al., 1998; Leger-Silvestre et al., 2004). Se desconoce la indentidad de la proteína adaptadora que se requiere para la interacción con Xpo1, pero se han propuesto varios factores como Ltv1, Dim2 y Rio2 (Seiser et al., 2006; Vanrobays et al., 2008; Zemp et al., 2009).

En el citoplasma la partículas pre-40S carecen aún de las RPs S10 y S26 y contienen varios factores de ensamblaje asociados que previenen un inicio de la traducción prematuro, como Pno1, Rio2, Nob1 o Tsr1 que se encuentran en los sitios de unión de factores de inicio de la traducción (eIF1, eIF1A y eIF3), de las proteínas S10 y S26 y además ocluyen el canal de entrada del mRNA. La disociación citoplasmática de estos factores de ensamblaje es necesaria para que finalice la maduración de la subunidad 40S (Strunk et al., 2011; Karbstein, 2011; Karbstein, 2013).

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El paso final de maduración de la partícula pre-40S es la dimetilación por Dim1 en el pre-rRNA 20S y el procesamiento en el sitio D por la endonucleasa Nob1 para originar el rRNA maduro 18S (Lafontaine et al., 1994; Lamanna y Karbstein, 2009). Según varios autores para que esto ocurra es necesario que la pre-partícula 40S se una a través del factor eIF5B a subunidades maduras 60S formando una partícula denominada “80S-like particle” (Lebaron et

al., 2012; Strunk et al., 2012; Garcia-Gomez et al., 2014).

c) Pre-partículas ribosómicas 60S

A diferencia de la maduración de las pre-partículas 40S, la maduración de las pre- partículas 60S en mucho más compleja y se puede dividir en las siguientes etapas: una etapa temprana, en la que se forma un complejo temprano estable pre-60S tras la síntesis del precursor 27SA2, hasta la formación de los pre-rRNA 27SA3, 27SBS o 27SBL; una etapa intermedia, en la

que ocurre el corte en el sitio C2 y se elimina el ITS2, formándose los pre-rRNAs 25.5S y 7S; y

una etapa tardía, en la que actúan las exonucleasas y el exosoma en el extremo 5´del 25.5S y 3´del 7S, preparando a los pre-ribosomas para su salida al citoplasma, donde finaliza su biosíntesis y se forman las subunidades ribosómicas maduras (Fig. 10).

La pre-partícula 60S más temprana está asociada a numerosos factores de ensamblaje que van a ser liberados durante su maduración a lo largo del nucleoplasma por la acción de enzimas dependientes de energía como helicasas, ATPasas y GTPasas, lo que les permite participar en nuevas rondas de biogénesis. De esta manera, la complejidad de las partículas precursoras es cada vez menor.

 Etapa temprana

Durante esta etapa el precursor 27SA2 es procesado para dar lugar al 27SA3, el cual a su

vez sufre la eliminación de la región ITS1 por medio de la acción de 12 “factores A3”entre los

que se encuentran Ebp2, Nop7, Erb1, Ytm1, Rlp7, Nop15 y Cic1 (Miles et al., 2004; Jakovljevic et al., 2012; Shimoji et al., 2012). Estos factores se ensamblan de forma jerárquica siendo todos ellos interdependientes para su incorporación y necesarios para la posterior asociación de Drs1 y Has1 (Sahasranaman et al., 2011; Dembowski et al., 2013). En esta etapa suceden varios cambios en la composición de los factores ribosómicos, como la asociación de la AAA-ATPasa Rix7 que se necesitará para la liberación de Nsa1 previa a la transición del nucléolo al nucleoplasma (Kressler et al., 2008). Mak5 está asociada con estas pre-partículas que contienen Nsa1 y parece interaccionar con una serie de factores como Ebp2, Nop16 o Nop4 en lo que se ha denominado “cluster de Mak5”, organizando una serie de reordenamientos estructurales en la región de la subunidad 60S en la que se encuentra L16, L6, L14 y los segmentos de expansión ES7L y ES39L (Pratte et al., 2013).

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Otro evento importante que ocurre durante esta etapa temprana es la incorporación del rRNA maduro 5S en un complejo con las proteínas ribosómicas L5 y L11 y el adaptador Syo1 (Ciganda y Williams, 2011; Kressler et al., 2012).

Figura 10. Representación esquemática de la maduración de las subunidades ribosómicas 60S y 40S en S.

cerevisiae. El reclutamiento co-transcripcional de RPs y de factores de ensamblaje (procesoma) al pre-rRNA 35S origina el precursor ribosómico más temprano, la partícula 90S. El corte en el sitio A2 separa estos pre-ribosomas

90S en las partículas pre-40S y pre-60S, cuya maduración es independiente. La asociación transitoria de factores de ensamblaje dirige esta maduración a lo largo de varias pre-partículas desde el nucleoplasma hasta el citoplasma, donde finalmente se formarán las subunidades ribosómicas 40S y 60S competentes para la traducción. Se indica la asociación y disociación de algunos factores, así como los pre-rRNAs más abundantes en las diferentes pre- partículas entre paréntesis (Adaptada de M. Bonshack).

 Etapa intermedia

Durante esta etapa, ya en el nucleoplasma, tiene lugar el procesamiento del pre-rRNA 27SB, eliminándose la secuencia ITS2 por el corte en C2 que origina los precursores 25.5S y 7S.

Para ello son necesarios 14 factores de ensamblaje denominados factores B (Talkish et al., 2012), entre los que se encuentran Nsa2, Rlp24, Nip7, las helicasas Has1, Spb4, Drs1 y Dbp10 y las GTPasas Nog1 y Nog2. La mayoría de los factores A3 y de los factores B se asocian en los

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ITS2 (Saveanu et al., 2001; Lebreton et al., 2006; Sahasranaman et al., 2011; Talkish et al., 2012).

 Etapa tardía

En esta etapa ocurren los últimos reordenamientos nucleares, que provocan la disociación de la mayoría de factores ribosómicos junto con el exporte de las pre-partículas al citoplasma. Además, en esta etapa finaliza el procesamiento del pre-rRNA 25.5S al rRNA maduro 25S y el del extremo 3’ del precursor 7S, el cual comienza en el núcleo por la acción del exosoma originando el precursor 6S, que finalmente será procesado en el citoplasma dando lugar al rRNA maduro 5.8S (van Hoof et al., 2000).

Una vez que las pre-partículas 60S han adquirido la competencia para ser exportadas, atraviesan los complejos de poro nuclear gracias a la acción de varios adaptadores como Mex67-Mtr2, Nmd3-Xpo1, Arx1-Alb1, Ecm1 y Bud20 que interaccionan con las repeticiones de fenilalalina-glicina (FG) de las nucleoporinas permitiendo a las pre-partículas 60S casi maduras alcanzar el citoplasma (Santos-Rosa et al., 1998; Gadal et al.,2001; Hedges et al., 2005; Bradatsch et al., 2007; Yao et al., 2007; Hung et al., 2008; Bradatsch et al., 2012; Bassler

et al., 2012). Por otra parte, Nmd3 y Tif6 permanecen unidos en la zona de las pre-partículas

60S donde contacta la subunidad 40S, evitando asociaciones prematuras de ambas subunidades (Gartmann et al., 2010; Sengupta et al., 2010).

La maduración final de las pre-partículas 60S ocurre ya en el citoplasma e incluye la disociación de los factores de biogénesis, la incorporación de las últimas RPs y los eventos finales del procesamiento del rRNA. Estas etapas, van a ser cruciales para completar la maduración de las subunidades 60S, pero también para las siguiente rondas de biogénesis, ya que los factores de ensamblaje y exporte deben disociarse y reciclarse correctamente.

El primer paso de la maduración citoplasmática es la disociación de Rlp24 (“ribosomal like protein”) por la acción de la AAA-ATPasa Drg1, que implica al mismo tiempo el ensamblaje de la proteína ribosómica L24. Esto desencadena un mecanismo de “dominó” que provoca que el resto de factores se disocien de una manera secuencial y ordenada (Lo et al., 2010; Kappel et al., 2012). Paralelamente, la proteína L12 recluta al factor Yvh1, que cataliza la sustitución de Mrt4 por la proteína ribosómica P0 (Lo et al., 2009), formándose así el tallo ribosómico, que atrae además las GTPasas necesarias para la biogénesis de la subunidad 60S, incluida Efl1, que junto con el factor Sdo1, producen la liberación del factor Tif6 (Senger et al., 2001). Este paso está acoplado a la etapa final de la maduración de la subunidad 60S, donde ocurre la disociación de Nmd3 por la GTPasa Lsg1 (Kallstrom et al., 2003; Hedges et al., 2005).

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