Este ensayo fue llevado a cabo con la colaboración de la Dra. Luz Valero y el equipo técnico del Servicio de Proteómica del Centro de Investigación Príncipe Felipe.
8.1. Precipitación y digestión de proteínas y marcaje de los péptidos
Las muestras de fosfoproteínas fueron desaladas mediante una precipitación con metanol/cloroformo. En primer lugar se añaden 400 μL de metanol, después 100 μL de cloroformo y finalmente 300 μL de agua, agitando en el vortex en cada paso. Tras una primera centrifugación a 14.000g durante 1 min, se retira la fase acuosa y se vuelve a añadir 400 μL de metanol. Se realiza una nueva centrifugación y tras ella se retira el metanol sin alterar el pellet. Finalmente, las muestras se desecan totalmente en el Speed-Vac.
Las muestras son resuspendidas en 40 μL de tampón SB (0,05% SDS en tampón 0,5 M tetraetil-amonio pH 8,5) y se cuantifican por Bradford. Se toman extractos de 100 μg de cada muestra para el marcaje con los reactivos iTRAQ. Este proceso consiste resumidamente en reducir las muestras con fosfina (incubación a 60ºC durante 1 hora) y bloquear las cisteínas con metilmetanosulfonato (incubación a Tª ambiente durante 10 min), para luego realizar la digestión con 10 μL de la solución de tripsina durante 16 h a 37ºC.
Cada marcador iTRAQ es resuspendido en 70 μL de etanol y añadido a la muestra correspondiente (reporteros de masa 114, 116 y 117 fueron usados para control, RA-15min y RA-30min respectivamente). Se incuba durante 1h a temperatura ambiente y para finalizar se mezclan todas las muestras en un único tubo. Las etiquetas iTRAQ se unen a los péptidos a través de un grupo N-hidroxisuccimida que es capaz de reaccionar con el grupo amino N-terminal de los péptidos y el grupo amino de la cadena lateral de las lisinas (Figura 11).
Etiqueta isobárica
(Masa total = 145)“Balance”
(Masa = 145 – reportero)Reportero
(Masa = de 114 a 117)NHS
Grupo reactivo 114 115 116 117 31 30 29 28Etiqueta isobárica
(Masa total = 145)“Balance”
(Masa = 145 – reportero)Reportero
(Masa = de 114 a 117)NHS
Grupo reactivo 114 115 116 117 31 30 29 28Figura 11. Esquema de las etiquetas empleadas para el marcaje de péptidos en un ensayo iTRAQ. Constan de un reportero de masa
variable, que identifica cada una de las muestras a analizar sin alterar la carga ni la eficiencia de ionización del péptido, y un “balance” para que la masa total sea igual a 145 Da en todos los marcajes.
8.2. Primera dimensión: Cromatografía líquida (LC)
La muestra es secada, resuspendida en tampón A (20 mM tetraetil-amonio en agua, pH 11) y cargada en una columna de fase reversa Gemini 3μ C18 110A de 150 x 4 mm (Phenomenex) equilibrada en el mismo tampón. La elución se realizó con un gradiente lineal del 5% al 45% de tampón B (20 mM tetraetil-amonio en acetonitrilo) durante 60 min a un flujo de 150 μL/min. Se colectan fracciones de 1 min que se acidifican con TFA 10%. Se comprueba la
complejidad de cada fracción por MALDI-TOF/TOF y de acuerdo con ésta se combinan hasta un total de 12 fracciones. Por último, se secan mediante centrifugación en vacío.
8.3. Segunda dimensión: LC-MS
Cada fracción se resuspende en 18 μL de acetonitrilo 5%, TFA 0,1% (pH 1) y 5 μL de la muestra se cargan en un precolumna (PepMap C18, 300 μm x 5 mm, LC Packings) donde se preconcentran y desalan mediante un flujo isocrático de TFA 0,1% a 40 μL/min durante 5 min. A continuación, los péptidos son eluídos en una columna analítica (PepMap C18 3μ 100A, 75 μm x 15 cm, LC Packings) previamente equilibrada con ácido fórmico 0,1%. La elución se llevó a cabo con un gradiente linear de 15-50% de disolución B (95% acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico) durante 120 min a un flujo de 300 nL/min. Los péptidos eluídos fueron analizados con un espectrómetro de masas nano-ESI-Q-TOF (QSTAR-XL, Applied Biosystems) en el modo de adquisición dependiente de información (IDA).
8.4. Identificación de proteínas
En la figura 12 se muestra un ejemplo simplificado de cómo el análisis MS/MS permite al mismo tiempo la identificación y cuantificación relativa de los péptidos. Los espectros MS/MS fueron analizados empleando el software Protein Pilot v2.0 (Applied Biosystems), que emplea el algoritmo Paragon para la identificación de proteínas por búsqueda en bases de datos y la comparación cuantitativa por cuantificación del área de los picos de los iones reporteros, y el algoritmo Progroup para el agrupamiento de proteínas que elimina los resultados redundantes. La base de datos de proteínas
del Swiss Prot (con taxonomía fijada en Homo Sapiens) fue la utilizada en todas las búsquedas. Alrededor de 150 proteínas fueron identificadas en cada uno de los tres ensayos iTRAQ realizados.
Figura 12. Esquema simplificado de un ensayo iTRAQ. Los
péptidos marcados con los distintos reporteros son combinados y analizados mediante una espectrometría de masas en tándem. Los espectros de MS/MS de cada péptido proporcionan por un lado información de la secuencia del péptido, lo que permitirá identificar la proteína de la que provienen, y simultáneamente, la integración de las áreas de los iones reporteros permite la cuantificación relativa de los péptidos entre las distintas muestras de interés.
8.5. Análisis de resultados y criterios de selección
Para evitar la presencia de falsos positivos, se fijaron una serie de condiciones restrictivas durante el análisis de los resultados. Así, únicamente se tuvieron en cuenta las proteínas identificadas con una confianza > 95% según la determinación del Protein Pilot. Respecto a la cuantificación, sólo se consideraron aquellos cambios significativos estadísticamente (p-value < 0,05). Las proteínas finalmente seleccionadas mostraban al menos en dos de los tres ensayos realizados una misma tendencia de cambio respecto al caso control.
Para el caso de los sitios específicos de fosforilación identificados, sólo se consideraron aquellos péptidos determinados
como fosforilados según el Protein Pilot con un valor de confianza ≥ 95%.
8.6. Análisis bioinformático mediante la aplicación FatiGO
El agrupamiento de proteínas se realizó empleando la herramiento FatiGO (y dentro de ella la opción “Search”) del paquete Babelomics v4.0 (Al-Shahrour et al., 2008). Las proteínas seleccionadas como “fosforiladas” y “desfosforiladas” fueron agrupadas por separado acorde a los criterios de “Proceso Biológico” y “Función Molecular”.