Se empleó el reactivo fotoactivable 125I-TID-PC (Figura 4.1) para evidenciar la interacción física de las FABP con bicapas fosfolipídicas modelo según un ensayo fotomarcación (Weber, J. Am. Chem. Soc. 1995; Corsico, J. Biol. Chem. 2001). Las vesículas se preparan con este reactivo por extrusión a través de una membrana de policarbonato, y son incubadas con la proteína. El sistema luego se deslipidiza y se analiza la marca radioactiva que queda en la
proteína luego de separarla en un gel de SDS-PAGE por autorradiografía (Figura 4.2).
Figura 4.2 – Ensayo de fotomarcación. La figura muestra un esquema con los distintos pasos del ensayo de marcación hidrofóbica de FABP con 125I-TID-PC. La extracción de lípidos se realiza según la técnica de Folch, las proteínas son precipitadas con acetona previamente a la siembra en el gel de SDS-PAGE y los geles son secados antes de la incubación con la placa radiográfica.
La Figura 4.3 muestra un resultado representativo de 3 repeticiones para analizar la interacción de las FABP intestinales con membranas de distinta composición y el efecto de la presencia del ligando. Puede observarse como la proteína IFABP interactúa con las membranas y pareciera que dicha interacción aumenta con la incorporación de cargas negativas en la membrana (PS y CL 25% respectivamente) respecto a las vesículas de 100% EPC (calle 1). También se observa que la interacción es promovida por la presencia del ligando (oleato en este caso) para las distintas composiciones de fosfolípidos, pero las diferencias apo- vs. holo- se diluyen con el aumento de la carga negativa de las membranas (calle 2). Estos resultados son compatibles con los resultados de transferencia de ligandos detallados en el capítulo anterior, en los que se observaba un aumento
de las membranas aceptoras. Si la etapa limitante del mecanismo colisional es dicha interacción y la misma está favorecida por lo que se observa en la autorradiografía del ensayo con el reactivo fotoactivable, es fácil de explicar entonces el aumento en la velocidad de transferencia que se registra en estas condiciones.
Figura 4.3. - Ensayo de Fotomarcación con 125I-TID-PC de FABP intestinales. La capacidad de interacción de las FABP intestinales nativas con membranas está modulada por la composición lipídica de las vesículas y por la presencia del ligando (oleato). Los paneles A, B y C muestran un resultado representativo de al menos 3 repeticiones para la marcación de las proteínas en sus formas apo- y holo- frente a vesículas de 100% EPC, 25% PS y 25% CL respectivamente.
Por otro lado, también se evidenció la interacción de la LFABP con las membranas fosfolipídicas, en especial en la forma apo-, es decir, desprovista de ligandos. Sin embargo, en este caso no se observan diferencias significativas debido a cambios en la composición de las vesículas (Figura 4.3, calle 3). Pero la presencia del ligando parece inhibir fuertemente la interacción de LFABP con las membranas (calle 4). Aunque inesperados, estos resultados no contradicen los
datos ya publicados y ampliamente aceptados de las propiedades de transferencia de ligandos desde LFABP, que se comporta como si empleara un mecanismo de tipo difusional. Es probable que LFABP sea capaz de interaccionar con membranas, aunque dicha interacción no sea el paso limitante en la transferencia de ligandos, como se evidencia en los ensayos de transferencia (Hsu, J. Biol. Chem. 1996; Córsico, Biochemistry 2004). Por otra parte, como se observa en la Figura 4.5, la interacción de la forma holo parece ser despreciable en comparación con la holo-LFABP, lo que concuerda con los ensayos de transferencia de FA hacia membranas. Por otro lado, la interacción con membranas en los ensayos in vitro podrían estar funcionando sólo como un reemplazo de las interacciones que LFABP muestra in vivo con otras proteínas, de membrana o solubles, que serían los verdaderos aceptores/dadores de los FA para LFABP.
Por último, se observa que la proteína HL-IFABP, que carece de la región
α-helicoidal, no parece mostrar capacidad de interacción con membranas en general (Figura 4.4, panel A). Este resultado está de acuerdo con la pérdida del mecanismo colisional de transferencia de FA desde HL-IFABP (Córsico Proc Natl. Acad. Sci. 1998) y es coincidente como pérdida en su capacidad de interacción con membranas que se reportó previamente empleado técnicas de espectroscopia IR (Wu, Biochemistry 2001). Por tal motivo, la proteína HL-IFABP se empleó en todos los experimentos subsiguientes como control negativo del ensayo. El ensayo de fotomarcación también fue realizado con los mutantes puntuales K27E, K29E y K92E a fin de dilucidar si alguno de ellos mostraban alteraciones en su capacidad de interacción con membranas con carga negativa (25% CL) que pudieran explicar los cambios en las propiedades de transferencia de análogos fluorescentes de FA observadas para los mutantes de α−II. Sin embargo, ninguno de los mutantes puntuales mostró cambios significativos con respecto a la proteína nativa de intestino. Esto nos indica que son necesarios modificaciones más drásticas para alterar la capacidad de interacción con membranas, aún cuando sí sean afectadas las propiedades de transferencia de ligandos (ver Capítulo 3). Esto induce a pensar que el efecto de las mutaciones puntuales podría estar vinculado con los pasos subsiguientes a la colisión de
IFABP con la membrana aceptora, ya sea el cambio conformacional de IFABP en la interfase de la membrana y/o la liberación del ligando y su incorporación a la membrana (ver Capítulo 3).
Figura 4.4. - Interacción de distintas variantes de IFABP con membranas. El panel A
muestra la capacidad disminuida de interacción de la variante de IFABP carente de la región α-helicoidal con membranas de EPC:CL 3:1. El panel B muestra el mismo análisis para mutantes puntuales de Lys de la región α-II y de la posición 92, para los cuales no se observan diferencias respecto a la proteína nativa.