Para los ensayos de calorimetría diferencial de barrido se utilizó un calorímetro Q100 (TA Instruments, EE.UU) provisto de dispositivo de enfriamiento con N2
líquido. Para la calibración del equipo se utilizó un patrón de Indio. El análisis de los termogramas fue realizado con el software provisto con el equipo, TA Universal Analysis (EEUU).
Se colocaron pequeñas cantidades de muestra (10-14 mg) pesadas en la precisión de 0,00001 mg en cápsulas de aluminio que luego se sellaron herméticamente. Las cápsulas se colocaron en la celda del equipo junto a una cápsula vacía utilizada como referencia. Se realizaron tres tipos de ensayos cuyos protocolos se describen a continuación.
3.3.2.1 Determinación de agua congelable y temperaturas de transición vítrea
En estos ensayos se congelaron las muestras a una temperatura cercana a los -40ºC para obtener la entalpía de fusión del hielo y luego determinar a partir de ella, la cantidad de agua congelable. Las muestras se equilibraron dentro de la celda del equipo a 20 ºC durante 5 minutos. Luego fueron congeladas a una
velocidad de 2°C min-1 y templadas a -40°C por una hora para obtener masas con una concentración máxima de solutos en la matriz no congelada. En este tipo de ensayos la temperatura de templado elegida se localiza ligeramente por debajo del valor de Tg. Posteriormente, las muestras fueron calentadas a velocidad constante de 2°C min-1 hasta alcanzar los 20°C, registrándose en
esta etapa la endoterma de fusión del hielo.
Del área de los termogramas, se determinaron las entalpías involucradas en la transición y la cantidad de hielo fue calculada a través de la constante de fusión del hielo (333 J/g). El agua total fue determinada por deshidratación a 105 ºC. El agua congelable se informó como un porcentaje del total de acuerdo a la ec. 3.2 100 / 333 % x total agua g g J congelable agua
H
fusiónhielo
(3.2)Las temperaturas asociadas a la transición vítrea (inicial y final) fueron calculadas a través del programa del equipo en la región donde se produjo el cambio en la línea de base del termograma. Los ensayos se realizaron al menos por cuadruplicado.
3.3.2.2Gelatinización del almidón
Las muestras con hidratación adaptada (CONDICION 2) se sometieron a un calentamiento programado desde 20°C a 130°C a una velocidad de 10°C min-1. Adicionalmente, para ver si en condiciones de hidratación restringida se
observaba un efecto sobre las temperaturas y la entalpía de gelatinización, una serie de muestras de masa fresca preparadas en esta condición de hidratación (CONDICION 1) se liofilizaron y luego se rehidrataron hasta un valor constante e igual en todos los casos (0,5 g de agua /g de sólido o 0,2 g de agua /g de sólido). La masa liofilizada se rehidrató en un eppendorff, se mezcló con una
espátula durante 1 minuto y luego se dejó en equilibrio durante 1 hora. Alícuotas de alrededor de 10 mg se encapsularon y se corrieron con el protocolo descripto.
De los termogramas se obtuvieron la temperatura inicial (Ti), de picos (TPI y TPII) y temperatura final (Tf) y las entalpías de gelatinización (∆H gelatinización). Se realizaron cuadruplicados de los ensayos.
3.3.2.3 Interacción proteínas de gluten-hidrocoloide 3.3.2.3.1 Análisis por calorimetría diferencial de barrido A. Extracción secuencial de las proteínas de gluten
La extracción de proteínas se realizó bajo un procedimiento secuencial del tipo Osborne (Osborne, 1957) a partir de 20 g de masas sin hidrocoloide liofilizadas, preparadas según lo descripto en el ítem 3.2.1 utilizando 100 ml de cada solvente (Puppo y col. 2005).
Se emplearon las siguientes soluciones:
1) NaCl 0,15M para albúminas y globulinas 2) 1-propanol 50% para gliadinas
3) ácido acético 0,1M para gluteninas
Cada etapa de extracción incluyó 30 minutos de agitación continua, seguidos por centrifugación a 1000 xg durante 10 minutos. Luego de cada extracción el residuo fue lavado con las respectivas soluciones, descartando el sobrenadante. Los extractos de 1-propanol y de ácido acético se liofilizaron y almacenaron en envases herméticos hasta el momento de su uso.
B. Condiciones del ensayo
Los ensayos se realizaron en un calorímetro Q100 (TA Instruments), utilizando una cápsula vacía como referencia. Se pesaron alrededor de 10 mg de una mezcla proteína:hidrocoloide:agua. Esta mezcla se preparó pesando
cantidades de gliadina o glutenina liofilizada, hidrocoloide y agua de modo de lograr una relación 1:1:2. Las cápsulas se sellaron herméticamente y se calentaron a 10ºC/min de 20 a 120ºC. Se analizó el efecto de los hidrocoloides en las propiedades térmicas de gliadinas y gluteninas.
3.3.3Espectroscopía FT- Raman
3.3.3.1Obtención del gluten
La obtención del gluten se realizó a partir de las masas preparadas con los distintos hidrocoloides en concentración de 1,5% (base 100 g de harina). Para este ensayo se utilizó un equipo Glutomatic (Glutomatic, EE.UU). Se modificó el protocolo usual para la determinación de gluten (38-12A, AACC, 2000) de modo de que las masas hubieran alcanzado su óptimo desarrollo. Las masas preparadas en la amasadora del farinógrafo utilizando condiciones óptimas, se colocaron en el recipiente del Glutomatic y fueron amasadas durante 60 segundos adicionales antes de ser sometidas al lavado con agua a 25 ºC por 5 minutos. El gluten obtenido se liofilizó en un equipo Heto-FD4 (Heto-Holten, Dinamarca), se pulverizó con un molinillo KG30 (Delonghi, Italia) y se guardó en envases herméticos hasta el momento de su uso. Las muestras fueron identificadas como: gluten, gluten-GG, gluten-GX, gluten-P, gluten-LBG según el hidrocoloide utilizado.
3.3.3.2 Obtención de los espectros
Los espectros Raman fueron obtenidos utilizando un espectrofotómetro Bruker IFS 113 FT-IR (Bruker Optics, Alemania) provisto con el accesorio NIR Raman equipado con láser Nd:YAG a 1064 nm. La calibración de la frecuencia del instrumento se realizó usando la línea de sulfuro a 217 cm-1. El espectro fue
registrado con una potencia láser de 500 mW y una resolución espectral de 6 cm-1 a temperatura ambiente. Cada espectro fue obtenido a partir de un promedio de 1000 escaneos con el objeto de lograr una relación señal/ruido alta. Los espectros FT-Raman fueron graficados como intensidad (unidades arbitrarias) en función del desplazamiento de número de onda (cm-1). Todos los
espectros fueron normalizados en todo el rango (4000–500 cm-1). El graficado, procesamiento, normalización, manipulación y evaluación de los espectros se realizó a través del software OPUS (Bruker Optics, Alemania). Las intensidades de las bandas fueron calculadas luego de una corrección de la base de línea realizada con un método de integración desarrollado dentro del software OPUS. Los valores de intensidades obtenidos para el doblete tirosina se calcularon en relación a la línea de base local de cada pico (830 y 850 cm-1). La asignación de bandas de los mayores movimientos de vibración de las cadenas laterales o de la cadena principal peptídica fue basada en la comparación de los datos Raman informados en la literatura (Tu 1982; Yu y col. 1973, Lord y col. 1970; Sugeta y col. 1970). Todos los análisis fueron realizados en tres experimentos independientes y los resultados se expresaron como promedio entre estos replicados. No fue posible realizar un buen espectro Raman para el sistema gluten-LBG+GX por esta razón los datos obtenidos no fueron incluidos.
3.3.4 Perfiles electroforéticos de los extractos proteicos obtenidos de