Ensayos de cambio en la movilidad electroforética

Los ensayos de cambio en la movilidad electroforética se realizaron usando como sondas fragmentos de DNA de entre 130 y 350 pb con las regiones de interés, indicadas más adelante en el texto. Los distintos fragmentos se obtuvieron por PCR empleando un oligonucleótido marcado previamente en su extremo 5´ con [γ32_{P]ATP y} quinasa de polinucleótido de T4 de Amersham Biosciences. Tras la amplificación, la radiactividad no incorporada se eliminó mediante centrifugación en columna de Sephadex G-25 (DNA grade, Amersham Biosciences) y el fragmento se purificó con el kit High PureTM PCR Product Amplification (Roche).

La reacción de unión se realizó en un volumen de 20 µl que contenía 1-3 pM del fragmento de DNA marcado (~6.000 cpm) y las cantidades necesarias de las proteínas, en un tampón de reacción que contenía ~ 80 mM KCl, 25 mM Tris pH 8, 1 mM DTT, 10 mM MgCl2, 50 ng/μl de BSA (albúmina de suero bovino)y glicerol al 10%, con o sin 1 µg de poli[dG-dC] o poli[dI-dC], como competidor no específico. Las muestras fueron incubadas durante 30 minutos a 37 °C. Tras dicha incubación, cuando fue necesario, se añadió 1 µg de heparina y se incubó 5 minutos a 37 ºC, las muestras se sometieron entonces a electroforesis en un gel de acrilamida no desnaturalizante al 4% a 10 ºC durante 40-50 minutos.

II.19.1 Transcripción in vitro

Esta reacción se realizó en un volumen de 30 μl (en agua Milli-Q tratada con 0,2 % de DEPC

)

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DTT 1 mM

BSA 50 ng/μl

Glicerol 10 %

Inhibidor de RNasa 20 unidades Fragmento de DNA molde 0,5 nM RNAP de M. xanthus 130 nM

Antes de iniciar la reacción, esta mezcla se incubó durante 30 minutos a 37 ºC y, cuando fue necesario, con CdnL (o sus versiones mutadas). A continuación se añadió 1,5 μl de heparina a 1 mg/ml, permaneciendo otros 5 minutos a 37 ºC. La transcripción se inició por la adición de ATP, UTP y GTP (400 μM, concentración final de cada uno), CTP (20 μM) y [α32_{P]CTP (0,42 μM). Las muestras se incubaron otros} 15 minutos a 37 ºC y la reacción se detuvo añadiendo 50 μl de 15 mM EDTA. Se realizaron dos precipitaciones consecutivas con acetato/etanol para eliminar los nucleótidos radiactivos no incorporados, y los productos precipitados se sometieron a electroforesis en un gel de acrilamida desnaturalizante al 6 %.

II.20 Inmunoprecipitación de cromatina

A 50 ml de cultivo crecido hasta mitad de la fase logarítmica (D.O550~0,6-0,8 para M. xanthus y D.O660~0,4-0,6 para C. crescentus) en CTT (M. xanthus) o M2G (C. crescentus), se agregó formaldehido (Merck) a una concentración final del 1% y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave, para fijar las interacciones proteína-DNA y proteína-proteína. Para interrumpir la reacción se añadieron 2,5 ml de glicina a 2,1 M y se incubó 5 minutos más. Las células fueron entonces centrifugadas (8.000 rpm 10 minutos) y el precipitado celular se lavó 3 veces con PBS (Sigma) en frío y se congeló a -80 ºC hasta su uso. Dicho precipitado fue descongelado (sobre hielo picado) y resuspendido en 200 μl de solución de lisis A (con lisozima a 1 mg/ml), incubado 30 minutos a 37 ºC e inmediatamente enfriado en hielo. Se añadieron 800 μl de solucion de lisis B con cocktel inhibidor de proteasas

cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets de Roche. 300μl de la muestra lisada se sonicaron durante 12 ciclos (30 segundos de sonicación y 30

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segundos de descanso) en un Bioruptor®Plus UCD-300 de Diagenode para obtener fragmentos de DNA de un tamaño de ~0,5 Kb. La muestra se centrifugó 5 minutos a 13.000 rpm, el sobrenadante fue transferido a un tubo limpio que se centrifugó nuevamente 5 minutos a 13.000 rpm. Del sobrenadante obtenido de esta última centrifugación, se tomaron 20 μl como muestra sin inmunoprecipitar o “input” y el resto (~280 μl) se añadió a 30 μl de bolitas magnéticas Dynabeads® Protein A de Life Technologies sobre las que previamente había sido inmovilizado el anticuerpo contra la proteína de interés: para proteínas etiquetadas con el epítopo FLAG se utilizó el anticuerpo monoclonal ANTI-FLAG® M2 (F3165) de Sigma-Aldrich, para la subunidad β de la RNAP el anticuerpo monoclonal (8RB13) de ThermoFisher, para la subunidad σ70_/σA _{de la RNAP el anticuerpo monoclonal (2G10) de ThermoFisher. Para la} inmovilización del anticuerpo, 30 μl de bolitas magnéticas se lavaron dos veces con 1 ml de PBS + 5 mg/ml de BSA, tras lo cual se resuspendieron (PBS + BSA) en el volumen inicial de 30 μl y se incubaron con 2,5 μl de anticuerpo durante 4 horas a 4 ºC en rotación. Antes de ser añadidas a la muestra, se lavaron nuevamente dos veces con 1 ml de PBS + 5 mg/ml de BSA y se resuspendieron en el volumen inicial. La muestra junto al anticuerpo inmovilizado a las bolitas fue incubada toda la noche a 4 ºC rotando. Las bolitas fueron entonces lavadas dos veces con 1 ml de solución de lisis B, dos veces con 1 ml de solución de lisis B con 0,5 mM NaCl, dos veces con 1 ml de solución de lavado, y un último lavado con 1 ml de TE. Las bolitas se resuspendieron en 60 μl de TE + 1% SDS y se incubaron 10 minutos a 65 ºC para liberar la muestra de las bolitas. Se tomaron 40 μl que contenían el DNA unido a la proteína/s de interés y se les añadió 40 μl de TE + 1% SDS y 2,4 μl de proteinasa K (20 μg/ μl). Esta mezcla fue incubada a 42 ºC durante 2 horas con el objetivo de degradar las proteínas unidas al DNA y que dificultarían los análisis posteriores, seguido de 65 ºC durante 6 horas para eliminar el entrecruzamiento del DNA (consigo mismo y con las proteínas que no hayan sido degradadas por el tratamiento anterior). Por último, el DNA fue aislado con el kit High PureTM PCR Product Amplification

(Roche).El mismo proceso se llevó a cabo para el “input”. El DNA fue cuantificado mediante PCR cuantitativa (qPCR) a partir de curvas patrón realizadas con diluciones seriadas del “input” y cebadores que amplifican las regiones de interés. El enriquecimiento para cada promotor fue expresado como el ratio entre la cantidad de DNA para un promotor determinado y la cantidad para una región intragénica (control negativo) en relación a la cantidad de DNA inicial representada por la cantidad de DNA del “input”.

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