ENSAYOS DE COMPORTAMIENTO

3.3.1. PRUEBAS DE MEDIDA DE LA REACTIVIDAD A ESTÍMULOS NOCICEPTIVOS 3.3.1.1. Placa caliente unilateral

Esta prueba, diseñada para poder medir separadamente en ambas patas traseras la reactividad de los ratones a estímulos nociceptivos térmicos, ha sido desarrollada en nuestro laboratorio (Menéndez et al., 2002). Consiste en inmovilizar al ratón sujetándolo por la parte posterior del cuello, apoyar la planta de una de las patas traseras del animal sobre una placa caliente a 49 ± 0,1°C (IITC, Life Science) y medir el tiempo hasta su retirada. Se realizaron dos medidas alternativas en cada pata con un intervalo de 1 min y, en los casos en los que los fármacos se administraron localmente en la pata se consideraron las medias de ambas medidas obtenidas en cada pata por separado, mientras que cuando se midió la respuesta a fármacos administrados por vía sistémica, se calculó la media aritmética de los valores obtenidos en ambas patas. Cuando la variación entre las dos medidas fue elevada, a menudo debidos a movimientos espontáneos de los ratones durante el ensayo, se realizó una tercera medida. Aunque en la mayoría de los casos estos datos no se utilizaron, siempre se realizó una medida previa de las latencias unas 4-6 h antes del ensayo para habituar los ratones a la sujección y a la prueba. Se utilizó una temperatura en la que las latencias basales oscilan entre los 13 y los 15 s y se desecharon ratones con latencias superiores

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a 20 s. En todos los casos, se estableció un punto de corte para evitar daños tisulares de 30 s y si este valor se obtuvo en la primera medida, ya no se volvió a realizar otra.

3.3.1.2. Prueba de von Frey

Se basa en aplicar estímulos táctiles no nociceptivos en la planta de las patas traseras de los ratones mediante los filamentos de von Frey, con los que se ejerce una presión constante al producirse la flexión del mismo cuando se presiona contra la superficie de la pata. Los filamentos tienen distinto grosor y están calibrados para ejercer una presión creciente al aumentar el mismo. Siguiendo el protocolo generalmente utilizado en nuestro laboratorio (Baamonde et al., 2007), los ratones se colocaron en contenedores de cristal sobre una plataforma con un suelo de rejilla durante 1 h para su habituación. Los filamentos de von Frey (Stoelting) seleccionados corresponden a los calibres 2,44, 2,83, 3,22, 3,61, 4,08, 4,56 y se aplicaron mediante el método "up and down" (Chaplan et al., 1994). Cada filamento se aplicó a la parte central de la planta del animal evitando la zona de las almohadillas durante unos 3 s y en cada animal se realizaron 6 medidas con diferentes filamentos comenzando por la pata izquierda o derecha de forma aleatoria. El filamento aplicado en primer lugar fue el 3,61 y la respuesta se consideró positiva si provocaba el alzado, sacudida o lamido de la pata o incluso la extensión de los dedos o negativa si la pata permanecía inmóvil. La respuesta positiva fue seguida de la aplicación del siguiente filamento más fino y la negativa por la aplicación del filamento de mayor grosor. El umbral de respuesta del 50% (en gramos) se calculó mediante la siguiente fórmula: umbral de 50%(g)=(10Xf+κδ)/10.000; donde Xf es el valor del último filamento de von Frey aplicado, κ es un factor de corrección basado en el patrón de respuestas (procedente de la tabla de calibración de Dixon) y δ es la distancia media en unidades logarítmicas entre los estímulos (en este caso, 0,4). El valor de umbral de respuesta se consideró separadamente en cada pata.

3.3.1.3. Prueba de presión sobre la pata

Esta prueba es una adaptación para ratones (Baamonde et al., 2004) del método descrito inicialmente para ratas por Randall y Selitto (Randall y Selitto, 1957) y consiste en la aplicación en la pata del ratón de un estímulo mecánico nociceptivo. Los ratones se sujetan por la piel de la parte posterior del cuello y tras colocar una de las patas traseras sobre un soporte, se apoyó en la cara dorsal de la pata la punta redondeada de una pieza de metracrilato de forma cónica capaz de aplicar una presión creciente desde 0 a 750 g en un tiempo aproximado de 15 s (Ugo Basile 7200). El estímulo cesa cuando el ratón retira la pata o hace un movimiento de sacudida y se registra la presión

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ejercida hasta ese momento (umbral de retirada, en g). Se realizaron 2 medidas en cada pata por separado a intervalos de 1 min y, como se utilizó tras la administración sistémica de fármacos, se consideró la media de las medidas realizadas en cada pata.

3.3.2. MEDIDA GENERAL DE ACTIVIDAD (ACTIMETRÍA)

El actímetro (LE 8811, LSI Letica®_{) consiste básicamente en un marco cuadrado}

de 35 cm situado a 7 cm del suelo con unas células fotoeléctricas que, al interceptarse en el desplazamiento horizontal de los ratones permiten registrar un número de cuentas que corresponden aproximadamente al número de veces que un ratón pasa por la zona que registran los sensores. Aunque el valor obtenido en una medida arbitraria de actividad, su mayor o menor valor refleja el grado de movimiento del ratón. En el ensayo, los ratones se introducen en jaulas transparentes (268 x 215 x 141 mm) que se sitúan en el centro del actímetro. La actividad se registró durante 20 min en 4 intervalos de 5 min a partir del min 50 tras la administración. Durante los 3 días previos al experimento, se realizaron sesiones de habituación diarias durante 15 min. Tras la última prueba de adaptación, se tomaron las medidas de actividad y se dividieron los ratones en dos grupos cuyos valores medios de actividad inicial fueran equiparables.