2. OBJETIVOS
3.4. Desarrollo de ensayos de biorreconocimiento
3.4.2. Ensayos de reconocimiento con anticuerpos
3.4.2.1. Calibrado
Para el calibrado, se prepararon disoluciones del anticuerpo GAR-Cy5 en un intervalo de concentraciones comprendido entre 1 y 50 μg/mL en PBS 1×. Nueve réplicas (1 matriz de 3×3 puntos) de cada una de las disoluciones fueron impresas sobre las superficies de los chips, activadas mediante distintas metodologías. La intensidad de fluorescencia de los puntos impresos se registró utilizando el detector LFS, y la imagen obtenida se analizó con el software Genepix 6.0 para obtener la curva de calibrado.
3.4.2.2. Ensayos de inmovilización
Para el estudio de inmovilización fueron impresas en formato microarray (3×3) diferentes disoluciones de GAR-Cy5, con concentraciones comprendidas entre 5 y 200 μg/mL en PBS1×, incubando los chips en cámara oscura y húmeda durante 1 hora a 37 ºC . Finalmente, se realizaron varios lavados con tampón MES, agua y
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una disolución acuosa de AcOH 0,15 M. Los resultados de la inmovilización fueron leídos mediante LFS y cuantificados con el programa Genepix 6.0.3.4.2.3. Inmunoensayo para detección de BSA
Para este ensayo el anticuerpo antialbúmina de suero bovino (0,2 mg/mL en PBS1×) fue impreso en los chips mixtos Si3N4/SiO2 previamente activados
siguiendo las metodologías descritas anteriormente. Las muestras se incubaron durante 2 h a 37 ºC, y se lavaron con PBS-T y agua. Posteriormente, se depositaron 20 µL de OVA 1% en PBS1x a fin de bloquear los grupos activos residuales, se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, y se lavaron con PBS-T y agua. Tras el bloqueo, se depositaron 20 µL de diferentes diluciones de BSA-Cy5 (0,1-100 mg/mL en PBS1x) sobre los chips. El marcaje de BSA con Cy5 se realizó de acuerdo al protocolo proporcionado por el proveedor235. Tras 1 h de incubación en cámara húmeda a 37 ºC, los chips se lavaron con PBS-T. La señal de fluorescencia se leyó mediante LFS y se cuantificó con el software del equipo.
3.4.2.4. Aplicación de los ensayos a la detección del virus H1N1 de la gripe
aviaria en muestras de fluido oral sobre DVD
Protocolo del inmunoensayo para la detección del virus H1N1
Los inmunoensayos de detección del virus de la gripe aviaria fueron desarrollados en formato sandwich no competitivo. Para ello, las superficies de los DVDs químicamente activadas fueron divididas en 8 zonas, imprimiendo 8 matrices (2×8 puntos) de anticuerpo mAb(H1N1) (40 mg/mL en TC1×) sobre cada una de las
zonas. En cada matriz se imprimieron además dos filas de ocho puntos de anticuerpo marcado con biotina,236 como control positivo (mAb(H1N1)-BT), y otra
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incubación en cámara oscura y húmeda a temperatura ambiente, los discos fueron lavados con PBS-T y agua, y secados por centrifugación a 800 rpm.
Figura 15. Esquema de ensayo de detección del virus de la gripe aviaria.
Por otro lado, disoluciones de virus fraccionados (H1N1) fueron preparadas en
un intervalo comprendido entre 0-1 µg/mL en PBS1×. 35 µL de cada una de las disoluciones se depositaron y extendieron con ayuda de un cubreobjetos sobre las áreas impresas. Tras 15 min de incubación a temperatura ambiente, los discos fueron lavados con PBS-T y agua. A continuación, 800 µL de anticuerpo [mAb(H1N1)-BT (5 µg/mL en PBS1×)] fueron depositados sobre los DVDs y
extendidos homogéneamente con ayuda de un disco de PC de 0,6 mm de espesor. Tras incubar 15 min en cámara oscura y húmeda a temperatura ambiente, los discos se lavaron con PBS-T y agua, y se incubaron con estreptavidina-HRP (10μg/mL en PBS1×) durante 15 min a temperatura ambiente. Tras lavar el disco con PBS-T y agua, se dispensaron 800 µL de disolución de revelado (TMB), apareciendo un precipitado azul oscuro en aquellas zonas en las que se produce la detección del virus de la gripe aviaria, transcurridos 8 min. La intensidad del precipitado fue medida y cuantificada mediante el lector de CDs y el software Genepix 6.0.
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Los resultados obtenidos se representan en una curva de saturación, a partir de cuyo intervalo lineal pueden estimarse las concentraciones de las muestras.Detección del virus H1N1 en muestras de saliva
(a) Toma de muestra. Un total de ocho voluntarios sanos, cuatro hombres y cuatro mujeres, con una edad media de 30 años, participaron en el estudio. Todos ellos cumplían con los requisitos establecidos de no tener infección bacteriana en amígdalas y faringe, así como no haber tenido exposición conocida al virus de la gripe aviaria (por infección o por vacunación) durante el último año, con el fin de que no se produjeran interferencias en los resultados del ensayo. Las muestras de fluido oral fueron tomadas según el protocolo de Binax237 y almacenadas en nevera a 4 ºC, hasta un máximo de 24 h antes de la prueba.
(b) Protocolo de ensayo. Para la detección del virus de la gripe aviaria en fluido oral, las muestras fueron dopadas a diferentes concentraciones comprendidas dentro del intervalo lineal de la curva de saturación. Para cada muestra se realizaron 6 réplicas en diferentes discos (2 matrices 3×8, 48 puntos muestra/réplica), y se procedió tal y como se ha descrito en el protocolo de ensayo (apartado 3.4.2.4). Paralelamente, se realizó una réplica para cada una de las muestras sin dopar, con la finalidad de evaluar el efecto matriz y comprobar que estaban exentas de virus. Finalmente, se calcularon los porcentajes de recuperación a partir de los valores interpolados en la curva de saturación.
3.4.2.5. Aplicación a ensayos para detección de (mAb-HBsAg) mediante tecnología de guía de ondas plana
Para la detección de anticuerpos contra la hepatitis B, marcador de recuperación o inmunidad frente a la enfermedad, se empleó un formato indirecto. El ensayo se desarrolló según protocolo de trabajo patentado por Zeptosens238. Para ello, sobre
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los dispositivos de guía de ondas plana se depositaron matrices 2×4 conteniendo diferentes diluciones del antígeno de superficie (HBsAg) comprendidas entre 0,5-2 µg/mL. En cada una de las matrices se adicionaron dos columnas patrón que contenían anticuerpo GAR marcado con Alexa-647. Tras incubación durante 2 h y bloqueo con caseína, las superficies se trataron con el anticuerpo monoclonal de ratón del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, en un intervalo 0,00013- 130 µg/mL en suero humano diluido (1:300). Después se trató con anticuerpo mAb- Alexa-647, y se procedió a la lectura de fluorescencia mediante el Zeptoreader®.