Se estudió la unión del compuesto VS2.33 a FtsZ mediante sedimentación por ultracentrifugación analítica (Figura 37). La unión de VS2.33 (30 µM) a BsFtsZ (15 µM) se confirmó en este ensayo, donde se observa el complejo proteína – ligando formando una
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población mayoritaria que sedimenta a una velocidad de s20,w= 4.05 S. En presencia de
GDP o con GDP y VS2.33, en cambio, lo hace a s20,w=de 3.0 S, aunque hay que tener en
cuenta que se sigue observando una población minoritaria en presencia del ligando y proteína que sedimenta a s20,w= de 2.9 S. Estos resultados se pueden explicar con una
población monomérica, en los casos en los que hay presencia de GDP y de GDP con VS2.33, y una población oligomérica, en presencia únicamente del ligando.
En la muestra en la que no hay proteína, no se detecta sedimentación del compuesto (canal de absorbancia a 305 nm). Sucede lo mismo en presencia de GDP, dado que desplaza al ligando y éste no sedimenta al tratarse de moléculas pequeñas que no forman complejo con la proteína, por lo que no aparece monitorizado. En ausencia de GDP y en presencia de VS2.33, la proteína forma oligómeros que sedimentan a la misma velocidad a la que se detecta la absorción del compuesto, en esa misma muestra, en el canal de absorbancia a 305 nm. A partir del área de los picos y las concentraciones iniciales, se calculó que la relación de unión de moléculas de ligando por moléculas de proteína está alrededor de 0.9.
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Figura 37. Unión de VS2.33 a BsFtsZ determinado mediante un ensayo de velocidad de sedimentación por ultracentrifugación analítica. A. Distribución de los coeficientes
de sedimentación de la proteína c(s), medido con la óptica de interferencia, de 15 µM de BsFtsZ en presencia de 100 µM de GDP (línea negra), en presencia de 30 µM de VS2.33 (línea roja), y en presencia de ambos, GDP y VS2.33, 100 µM y 30 µM, respectivamente, (línea azul). B. Distribución de los coeficientes de sedimentación del ligando medidos por absorbancia radial a 310 nm del compuesto solo (línea verde), en presencia de BsFtsZ (línea roja) y con BsFtsZ y GDP (línea azul). C. Barridos radiales sucesivos de interferencia de la distribución de BsFtsZ durante el experimento en presencia del ligando VS2.33. D. Barridos de la absorbancia radial a 310 nm que permiten seguir la co-sedimentación del ligando en el mismo experimento que en C. E y F. son las mismas medidas que C y D (respectivamente) pero en este caso con las muestras que además llevan GDP. En F se observa que el ligando no sedimenta con la proteína por acción del GDP. Se muestran también los residuos de los ajustes. Todos los ensayos han sido realizados en tampón Hepes (pH 6.8), 10 mM MgCl2 y 2
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IV.2.2 Cristalografía del complejo proteína-ligando (BsFtsZ-VS2.33)
Las pruebas de cristalización de la proteína BsFtsZ sin inhibidor fueron exitosas, pues se obtuvieron cristales con una reproducibilidad y velocidad de crecimiento relativamente sencillas: en tan sólo 24 horas después de la preparación de las gotas (en el mismo tampón de purificación: tampón C). La condición inicial que más favoreció la obtención de cristales de buen tamaño y con un crecimiento adecuado fue 30 - 55 % PEG200, 0.1 M BIS-TRIS (pH 8.0) y 50 mM Li2SO4, incubando a 14 ó 20 ºC. Los cristales con proteína sin ligando
no se llevaron a difractar, pero sirvieron para establecer las condiciones iniciales para tratar de cristalizar la proteína en presencia de los ligandos. Se repitió el ensayo, esta vez con los ligandos VS2.25, VS2.33, VS2.36, VS2.48, VS2.54, VS2.58 y VS2.62, en presencia de la proteína. El éxito para la obtención de cristales fue el mismo; con el compuesto VS2.33 se obtuvieron los cristales más homogéneos pero todos ellos se llevaron a difractar. En la
Figura 38 se muestran algunos de los cristales obtenidos en presencia de VS2.33, ligando
con el que también se obtuvieron los mejores datos de difracción por rayos-X.
Figura 38. Cristales de BsFtsZ en presencia de VS2.33. Imágenes de los cristales obtenidos tras la co-
cristalización de BsFtsZ (2mg/mL) en presencia de 200 µM de VS2.33, a unas condiciones de cristalización de: 30 - 55 % PEG200, 0.1 M BIS-TRIS (pH 8.0) y 50 mM Li2SO4, incubando a 20 ºC.
La primera estructura que se resolvió de BsFtsZ en co-cristalización con 200 µM de VSA2.33, mostró una densidad en el sitio de unión de GTP que, debido a su pequeño tamaño no podía explicarse con el nucleótido ni con los ligandos empleados en la co- cristalización. La hipótesis inicial fue que la molécula debía ser algún componente empleado en las condiciones de cristalización de la muestra (30 - 55 % PEG200, 0.1 M BIS-TRIS (pH 8.0) y 50 mM Li2SO4). Se pensó en el (SO4)2-procedente de Li2SO4 usado
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Li2SO4. Afortunadamente, se consiguieron obtener cristales sin emplear este aditivo. No
obstante, la segunda vez que se recogieron datos con los cristales obtenidos en estas nuevas condiciones (30 - 55 % PEG200, 0.1 M BIS-TRIS, pH 8.0), volvió a detectarse la misma densidad en el bolsillo de unión del nucleótido de BsFtsZ. La explicación más plausible a este hecho señaló al sulfato de amonio empleado en la purificación de la proteína como elemento residual presente en la muestra. Este sulfato se posiciona en el bolsillo catalítico, en la región en la que el fosfato β del GTP quedaría posicionado, según muestra la estructura resuelta (Figura 39). El cristal mostró un empaquetamiento cristalino con un grupo espacial de tipo P212121. En la resolución de la estructura se observó que el BIS-
TRIS, empleado en las condiciones de cristalización, aparecía también unido al sitio de GTP, en una región que solapa con la ribosa del GTP en la estructura de referencia. La estructura resuelta sin ligando, permitió resolver una parte de la cadena peptídica de BsFtsZ que no se había resuelto hasta la fecha. Esta región se corresponde con los 11 primeros aminoácidos del extremo amino terminal.
Figura 39. Modelos superpuestos de la estructura cristalográfica obtenida por rayos-X y la estructura 2RHO. La nueva estructura (pendiente de depositar en el PDB) muestra la región del extremo N-terminal
desestructurado (11 aminoácidos, color azul), no resuelto hasta la fecha. En el sitio catalítico hay un sulfato (color rojo) y BIS-TRIS (color violeta), y ambos solapan con el GTP (color amarillo) del modelo 2RHO (color marrón). El refinamiento de los datos para resolver la estructura (Tabla 4) se muestra en el apartado III.6.1.4 de
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