Ensayos de retardo (EMSA)

6.3.1. Principios metodológicos de los ensayos de retardo

Los ensayos de retardo o EMSAs permiten definir posibles interacciones entre proteínas específicas y secuencias de ADN. Básicamente, constan de tres fases:

1. Una incubación inicial, en la que se incorporan extractos proteicos y oligonucleótidos de cadena doble marcados con γ32-ATP (radiactivo). Esta incubación se realiza en unas condiciones salinas bien definidas que promueven el establecimiento de interacciones similares a las que ocurren in vivo.

2. Una electroforesis no desnaturalizante en gel de poliacrilamida, en la que se incluyen las muestras anteriores, así como controles negativos (ADN sin extracto proteico). En caso de producirse unión entre alguna de las proteínas del extracto proteico y la secuencia de ADN, se producirá un retraso en la migración del complejo con respecto a la cadena libre de ADN.

3. Este retraso se visualiza gracias a la presencia de radiactividad en la cadena de ADN. Para ello, se seca el gel y se coloca junto a una película autoradiográfica.

Para definir qué proteína se une de forma específica al ADN, se pueden completar estos ensayos mediante: a) la incorporación a la incubación inicial de anticuerpos frente a posibles proteínas de unión, lo que produce un mayor retardo del complejo; b) el diseño de oligonucleótidos que contengan secuencias consenso de unión de dichos factores, y que actúan como controles positivos; y c) el uso de extractos purificados de proteínas candidatas, con lo que se demuestra si realmente producen retraso al unirse al ADN (figura M13).

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Figura M13. Esquema de los ensayos de retardo o EMSAs. La unión de proteínas a sondas de

ADN, marcadas con fósforo radiactivo, y de secuencias determinadas, determina la movilidad electroforética, produciéndose un retardo cuando se produce la interacción (calles 2 y 5). La especificidad del retardo puede comprobarse mediante el empleo de un exceso de sondas no marcadas con secuencias similares o consenso (calles 3 y 6), el empleo de extractos de proteína conocida (calles 5-7) y la adición de anticuerpos específicos (calles 4 y 7).

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6.3.2. Ensayos de retardo referidos a FOXE1

Diseñamos un EMSA para evaluar el efecto del SNP rs1867277 del promotor de FOXE1 sobre la unión de factores de transcripción específicos. Para la obtención de los extractos proteicos se siguieron los procedimientos estándar (Andrews and Faller, 1991). Para la síntesis de proteínas específicas, se empleó el sistema TNT acoplado a lisado de reticulocitos (Promega), que permite la transcripción y traducción in vitro. Utilizamos los vectores de expresión de USF1/2 pN3 y pN4. Siete µg de proteína total, o alternativamente 3 μl de proteína específica obtenida mediante el sistema TNT, fueron incubados con 200 ng de las sondas de ADN de doble cadena correspondientes, previamente marcadas con γ32_{-ATP mediante la polinucleótido kinasa T4. Las}

secuencias de las sondas empleadas fueron rs1867277-A: 5’-gtcccggtcAcgaggccaccg-3’ (abreviada como “alelo A”); rs1867277-G: 5’- gtcccggtcGcgaggccaccg-3’ (“alelo G”); y el elemento DRE del gen de la prodinorfina: 5’- gaagccggagtcaaggaggcccctg-3’ (“DRE- pDyn”). Para los ensayos de competición, se utilizó un exceso de 100 veces del mismo oligonucleótido (en cada caso) o de un oligonucleótido no relacionado (5’- ccataatgcaaaaatggaaagaattaaa-3’) y no marcado (“frío”). También se utilizaron las siguientes sondas de ADN: la secuencia consenso de unión de USF (5’- cctgcccacgtgacccggcct-3’; “USF-consenso”); la secuencia de unión de CRE del gen de la somatostatina (5’-cctcctagcctgacgtcagagagagagt-3’; “CRE-consenso”); y la región similar a la secuencia consenso de unión a CRE presente en el promotor de FOXE1 (5’- accagagtcgagtcccggtcacgaggcca-3’; “CRE-FOXE1”). Además, se emplearon anticuerpos específicos que reconocían las proteínas DREAM, USF1, o USF2 humanas (sc-9142, sc- 229 y sc-862, respectivamente, de Santa Cruz Biotechnologies), y se incubaron junto a los extractos proteicos y los ADN de doble cadena.

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7. Estudios de interacción gen-gen o epistasia

Dado que es poco probable que una variante polimórfica en un único gen determine la susceptibilidad a desarrollar una enfermedad compleja como el cáncer de tiroides, uno de nuestros objetivos fue estudiar el efecto combinado de varias alteraciones. Para ello, se llevó a cabo un estudio de interacción gen-gen o epistasia. La epistasia puede definirse como la interacción entre variantes genéticas que da como resultado un efecto fenotípico condicionado por la acción coordinada de dichas variantes, y que no resulta de la suma de los efectos individuales de cada una de ellas (Dimas and Dermitzakis, 2009). Una representación gráfica de este efecto condicional está representada en la figura M14A.

El diseño de este estudio fue similar a un estudio caso-control clásico, pero teniendo en cuenta combinaciones de genotipos de pares de SNPs, en lugar de genotipos de una sola variante. Al igual que en el estudio individual de SNPs, se empleó la serie 1 como serie de descubrimiento, y las series 2+3 como validación de las interacciones significativas obtenidas en la primera fase.

De entre los algoritmos para la detección de epistasia disponibles, elegimos el método MB-MDR (“Model-Based Multifactor Dimensionality Reduction”) (Calle, et al., 2008), que amplía y mejora el algoritmo MDR original (Ritchie, et al., 2001). Básicamente, MB-MDR trabaja en tres fases:

1. En primer lugar, prueba todas las combinaciones posibles de SNPs (n=768, en nuestro caso) elegidos dos a dos, y establece combinaciones de genotipos de 3 categorías (fig M14B): riesgo (casos significativamente sobrerrepresentados), protección (controles significativamente sobrerrepresentados) y neutro (representación similar de casos y controles). Para cada pareja de SNPs, el programa realiza un test de regresión logística, que puede ser corregido por el efecto individual de cada SNP. Además, es posible realizar un ajuste por posibles factores de confusión (edad, género y origen, en nuestro estudio). 2. A continuación, el algoritmo agrupa las combinaciones de genotipos de riesgo,

protección y neutros, y los recodifica en una nueva variable, con la que realiza una nueva regresión logística.

3. Finalmente, el programa calcula el estadístico de Wald, a partir del cual, mediante un test de permutaciones, puede calcularse la significación estadística o P valor.

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Figura M14. Análisis de interacción gen-gen o epistasia. A. Representación esquemática del

efecto condicional sobre el fenotipo que producen dos variantes actuando de forma epistática (adaptado de Dimas & Dermitzakis, 2009); B. Salida del programa MDR para una pareja de SNPs, con la asignación de combinaciones de genotipos de riesgo (en rojo), protección (en verde) y neutros (en azul).

La elección de este algoritmo sobre otros se realizó al considerar que era el que más ventajas presentaba, como el hecho de no hacer ninguna selección a priori. La ventaja fundamental de MB-MDR, sin embargo, es que permite corregir por la contribución individual de cada SNP, de forma que el efecto observado se debe únicamente a la presencia de epistasia. Además ofrece la posibilidad de ajustar los P valores por posibles factores de confusión. La principal desventaja del método es que sólo considera parejas de SNPs, aunque la posibilidad de trabajar con combinaciones de más variantes estaría condicionada de todas formas por el tamaño muestral disponible, del que los estudios de epistasia, en general, son muy dependientes.

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