Enumeración de microorganismos viables

Para determinar la concentración de microorganismos viables en gránulos de kefir y productos fermentados se llevaron a cabo diluciones apropiadas en triptona 0,1 % p/v y se realizaron recuentos en placa empleándose agar MRS (ver Apéndice) para bacterias ácido lácticas (BAL) y agar YGC (ver Apéndice) para levaduras. Los gránulos de kefir fueron previamente disgregados en un mortero estéril. Los resultados se expresaron como unidades formadoras de colonia (UFC)/g para los gránulos de kefir y UFC/ml para los productos fermentados.

5. Microscopía electrónica de barrido

Para el análisis de gránulos de kefir por microscopía electrónica de barrido (MEB) se cortaron porciones de 1 a 2 mm de gránulos frescos. Los mismos fueron fijados durante 20 h con glutaraldehído (Riedel de Haen, Seelze, Germany) al 2 % v/v en buffer fosfato pH 7. Luego se llevó a cabo la deshidratación en soluciones crecientes de etanol (20, 50, 70, 90 y 100 %) en PBS, colocándose las muestras 1 h en cada concentración. Las muestras fueron montadas en tacos metálicos y cubiertas con Au 24 durante 10 min por evaporación en vacío (Fine Coat, Sputer JFC 1100). La observación se realizó en un microscopio electrónico de barrido Philips SEM 505 que cuenta con un programa para la obtención de imágenes digitales (Digitalizador de Imagen Soft Imaging System ADDA II (SIS)).

6. Obtención de la fracción no microbiana de kefir

Para la obtención de la fracción no microbiana de kefir, la leche fermentada se centrifugó a 10000 xg durante 15 min a temperatura ambiente utilizando una centrífuga Avanti J25 (Beckman Coulter Inc., USA). El sobrenadante obtenido, para ciertos experimentos, se neutralizó mediante el agregado de NaOH 5N, se centrifugó nuevamente en las mismas condiciones y se filtró con membrana de 0,45 µm (Osmonics) para obtener el sobrenadante libre de células. Para ensayos específicos, este producto se congeló a -80 °C y se liofilizó utilizando un liofilizador Heto FD4 con una bomba de vacío Vacuubrand RZ 5 y un condensador que se mantiene a -50 °C, con el fin de separar el agua por sublimación. El producto se resuspendió en PBS para obtener una solución 5 veces concentrada (en relación de volúmenes).

6.1. Caracterización de la fracción no microbiana de kefir

6.1.1. Determinación de azúcares en los productos fermentados: Cromatografía en capa fina

Se analizó la composición de los azúcares presentes en los productos fermentados mediante

cromatografía en capa fina (TLC, por sus siglas en ingles: Thin Lyer Cromatography) en

placas de Silica gel G (Merk D-64271, Alemania). Previo a la siembra las placas se activaron 5 min en estufa a 100 °C. La siembra se efectuó utilizando una microjeringa Hamilton

colocando μl de cada muestra en alícuotas de 1 μl cada una, esperando la evaporación del

solvente luego de cada alícuota, se aceleró el proceso utilizando una corriente de aire caliente (Southgate, 1976). Conjuntamente con las muestras, se sembraron patrones de glucosa, lactosa y galactosa. Los patrones se prepararon al 0,05 % p/v en solución etanol:agua (50:50). Una vez concluida la siembra las placas se colocaron en una cuba cerrada conteniendo el solvente de corrida o fase móvil (mezcla de n-propanol-acido acético-agua en relación 70:20:10), con atmosfera saturada en el mismo. Se permitió el avance de fase móvil hasta una distancia de 2 cm de la parte superior de la placa, se retiraron las mismas de la cuba y se secaron antes del revelado. Las placas se revelaron con

una solución de ácido p-aminobenzoico 7g/l y ácido o-fosfórico 30 g/l en metanol (Zweig &

Sherma, 1978); se evaporó el solvente revelador y se colocaron 5 min en estufa a 100°C para permitir la visualización de las marcas correspondientes a los hidratos de carbono. Se midió

la constante Rf (Ratio of Front), la cual es simplemente una manera de expresar la posición

de un compuesto sobre la placa como una fracción decimal y mide la retención de un componente. Se calculó el valor de Rf aplicando la siguiente relación: Distancia de la muestra desde el punto de siembra/distancia de la fase móvil desde el punto de siembra.

6.1.2. Cuantificación de azúcares totales en los productos fermentados

La concentración de azúcares totales en la fracción no microbiana de kefir obtenida por fermentación durante 24 y 48 h se realizó mediante el método de Antrona-sulfúrico (Southgate, 1976). La mayoría de los carbohidratos se pueden determinar mediante este método, pero en las condiciones descriptas a continuación es específico para hexosas. Todos los polisacáridos reaccionan en medio ácido fuerte dando un cromógeno (furfural y derivados) que condensan con el cromóforo (reactivo) para dar color. Para efectuar la valoración 0,2 ml de solución patrón, muestra o diluciones apropiadas de las mismas se colocaron en tubos de vidrio con tapa. Se adicionaron 2 ml de reactivo de Antrona, se agitó empleando un vortex y se llevó a baño de agua a ebullición durante 15 min. Luego se enfrió

a temperatura ambiente y se dejó en oscuridad durante 30 min. Finalmente se realizó la lectura de absorbancia a una longitud de onda de 620 nm utilizando un espectrofotómetro Henos Alpha & Beta (Thermo Spectronic, UK). En forma simultánea se realizó una curva de calibración con soluciones de glucosa de concentración conocida en un rango entre 0 y 500

μg/ml y se graficó A 620nm vs. Concentración. Con los datos de la regresión lineal se calculó la

concentración de polisacáridos en los productos fermentados.

Reactivo de Antrona: Se preparó una mezcla 66 % v/v de H2SO4 en agua trabajando en baño

de agua-hielo debido a la naturaleza fuertemente exotérmica de la disolución. Cuando dicha solución estuvo a una temperatura aproximada de 70°C, y para facilitar su disolución, se añadió antrona (9,10-dihidro-9-oxoantraceno) en concentración final 0,5 g/l. El reactivo se almacenó a 4 °C durante no más de dos semanas.

6.1.3. Determinación de ácidos orgánicos en productos fermentados

La determinación de ácidos orgánicos cualitativa y cuantitativamente se realizó mediante cromatografía líquida de alta presión utilizando una columna de intercambio iónico (IE- HPLC). Para la preparación de la muestra 1 ml de producto fermentado se centrifugó durante 10 min a 14000 x g. El sobrenadante obtenido se filtró a través de una membrana

de , 5 μm (Millipore Corporation, Milford, MA 1 5 , USA y μl del filtrado se

inyectaron en el cromatógrafo. Se utilizó una columna de intercambio iónico AMINEX HPX- 87H (BioRad Labs, Richmond, CA 94804, USA) y se obtuvo la absorbancia de los eluatos

mediante un detector UV a 1 nm (Waters ™ 99 , Millipore Corporation, Milford, MA

01757, USA), en un tiempo de corrida de 30 min. La determinación se llevó a cabo a una

velocidad de flujo de 0,7 ml/min, a 60 °C, utilizando H2SO4 0,009 N como fase móvil. La

identificación de los ácidos se basó en la comparación de los tiempos de retención con soluciones estándar o patrones de ácidos (Tabla 1.1). El tiempo de retención de los ácidos se obtuvo a partir del cromatograma obtenido al analizar una solución acuosa de los estándares preparados con reactivos de grado HPLC (Sigma Chemical Co.).

Tabla 1.1: Tiempo de retención de soluciones estándar de ácidos orgánicos.

Patrón Tiempo de retención

(min) Ácido oxálico 5,7 Ácido cítrico 6,4 Ácido ascórbico 7,2 Ácido pirúvico 7,4 Ácido málico 7,6 Ácido succínico 9,2 Ácido láctico 10,0 Ácido fórmico 11,0 Ácido acético 12,0 Ácido propiónico 14,0 Ácido isobutírico 16,0 Ácido butírico 17,4 Ácido isovalérico 20,0

Se realizaron curvas de calibración con ácido cítrico, ácido láctico, ácido acético, ácido propiónico y ácido butírico, mediante las cuales se calcularon las concentraciones de los mismos en las muestras.

6.1.4. Cuantificación de polisacárido en leches fermentadas con gránulos de kefir

Se realizó la extracción de exopolisacárido (EPS) a partir de leches fermentadas 24 y 48 horas, con gránulos de kefir CIDCA AGK1 y CIDCA AGK10 en relación 10 % p/v. Para ello se empleó un protocolo optimizado previamente puesto a punto por miembros del grupo de investigación. Se tomaron 60 ml de leche fermentada, se centrifugaron 10000 g 15 min. Los sobrenadantes fueron trasvasados a otro recipiente y tratados con 2 volúmenes de etanol frío, colocándose estas mezclas a 4 °C por 24 h para la precipitación del polisacárido. La separación del polisacárido se realizó por centrifugación a 10000 xg a 4 °C 15 min. El precipitado obtenido fue disuelto en 6 ml de agua destilada caliente. Posteriormente se dializó esta solución con membranas con un tamaño de corte de 1000 Da (Spectra/Por® 7, Spectrum Laboratories Inc., USA), equilibradas con 2 L de agua bidestilada, durante 48 h a

4 °C. De este modo se eliminaron restos de lactosa. Finalizada esta etapa se verificó la ausencia de hidratos de carbono de bajo peso molecular por cromatografía en capa fina, y posteriormente se determinó la concentración de polisacárido por el método de Antrona descripto previamente

6.1.5. Aproximación del grado de hidrólisis de proteínas lácteas

Se realizó una aproximación del grado de hidrólisis de las proteínas lácteas durante la fermentación de la leche por gránulos de kefir, mediante determinación del nitrógeno TCA soluble y electroforesis SDS-PAGE.

6.1.5.1. Determinación de nitrógeno TCA soluble

Como aproximación del grado de hidrólisis de proteínas lácteas que se produce durante la fermentación con gránulos de kefir, se realizó una determinación de nitrógeno TCA soluble por el método de Hull (1947) modificado por Sample y col., 1984 (reactivo Folin-Ciocalteau: ácido fosfomolíbdico-ácido fosfotúngstico). Para ello, se tomaron 2 ml de producto fermentado y se añadió ácido tricloroacético para obtener una concentración final del mismo del 8 % p/v. Se centrifugó 10 minutos a 7000 xg, se tomaron 0,5 ml de sobrenadante

y se le añadió 1 ml de solución de Na2CO3 15% p/v y hexametafosfatosódico 2% p/v, a los 5

min se añadieron 0,3 ml de reactivo de Folin-Ciocalteau (FC) diluído (1 volumen de reactivo FC en 2 volúmenes de agua destilada). Luego de 5 min, se realizó la lectura de absorbancia a 650 nm en un espectrofotómetro (Metrolab 330, Argentina). Se realizó una curva de calibración con solución de L-Tirosina con concentraciones entre 0 y 20 mg/100 ml. Se compararon los valores obtenidos entre los productos fermentados y con el control de leche sin fermentar.

6.1.5.2. Análisis del perfil electroforético

Mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS- PAGE) (Laemmli, 1970) se compararon los perfiles de proteínas de leches fermentadas con gránulos de kefir durante diferentes tiempos y de leche sin fermentar. También se analizaron las fracciones no microbianas por este método y mediante electroforesis Tricina SDS-PAGE (Schägger, 2006), con el objetivo de estudiar péptidos con baja masa molecular

(1_–100 kDa). La preparación de las muestras y soluciones, junto con el armado, corrida y

7. Evaluación de la susceptibilidad a la hidrolisis de las leches fermentadas con