Enzimas pectolíticas

Existe una pléyade de proteínas, con o sin actividad enzimática demostrada, que son responsables, potenciales o actuales, de la modificación de polímeros de la pared celular. A continuación, se realiza una breve descripción de las principales enzimas pectolíticas que, además de ser investigadas en otros frutos, fueron estudiadas en la aceituna, centrándose en las principales proteínas pectolíticas objeto de estudio de esta Tesis.

Las pectinas son degradadas por enzimas pectinolíticos, pectinasas, los cuales presentan gran diversidad, debida en parte a la compleja naturaleza del sustrato degradado. Las plantas y los microorganismos son los principales productores de estos enzimas (Naidu y Panda, 1998). La mayoría de las modificaciones de la pared, durante la maduración de los frutos, están asociadas con la degradación de los polisacáridos pécticos (Brummell et al., 2004), pero el momento y la velocidad a la que estos cambios ocurran, variarán en función de las características del fruto y de la variedad estudiada (Ali et al., 2004). Las pectinasas, cuya acción enzimática se muestra en la Figura 5, se clasifican en tres tipos principales: enzimas desesterificantes (pectinesterasas), enzimas despolimerizantes (hidrolasas y liasas) y protopectinasas (Kashyap et al., 2001).

Antecedentes

37 Figura 5. Esquema de la acción enzimática de las pectinasas.

PMGE: polimetilgalacturonato esterasa (pectinesterasa); PMGL: polimetilgalacturonato liasa (pectina liasa); PMG: polimetilgalacturonasa (pectina hidrolasa); PGL: poligalacturonato liasa (pectato liasa); PG: poligalacturonasa (pectato hidrolasa). Así, la pectín metilesterasa (PME) cataliza la desesterificación de la pectina, y los enzimas despolimerizantes catalizan la escisión del enlace glicosídico α-(1→4) de la cadena de galacturonano de la molécula de pectina. Los enzimas despolimerizantes pueden clasificarse, asimismo, en función del mecanismo de rotura de los enlaces glicosídicos. La Poligalacturonasa (PG) escinde los enlaces por medio de hidrólisis, mientras que la pectín liasa (PL) y la pectato liasa, lo hacen mediante β- eliminación. Además, el prefijo endo- o exo- denota el modo de acción de estos enzimas, al azar (enlaces internos) o terminal (Tabla 4).

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Tabla 4 . Clasificación de los enzimas pectinolíticos y su nombre de acuerdo con

la Comisión de Enzimas (EC) (Soriano, 2004).

Nombre recomendado por EC Nombre común Número EC Sustrato Modo de acción Desesterificación de sustratos

Pectin metil esterasa Pectinesterasa 3.1.1.11 Pectina Endo

Depolimerización de sustratos Hidrolasas

Endopoligalacturonasa Poligalacturonasa 3.2.1.15 Pectato Endo

Exopoligalacturonasa 1 Poligalacturonasa 3.2.1.67 Pectato Endo (terminal)

Exopoligalacturonasa 2 Poligalacturonasa 3.2.1.82 Pectato Exo (penúltimo enlace)

Endopolimetilgalacturonasa Pectina hidrolasa Pectina Endo

Exopolimetilgalacturonasa Pectina hidrolasa Pectina Exo

Liasas

Endopoligalacturonato liasa Pectato liasa 4.2.2.2 Pectato Endo

Exopoligalacturonato liasa Pectato liasa 4.2.2.9 Pectato Exo

Endopolimetilgalacturonato liasa Pectato liasa 4.2.2.10 Pectina Endo

Exopolimetilgalacturonato liasa Pectato liasa Pectina Exo

2.2.5.1. Enzimas desesterificantes: pectin metilesterasas (PME; EC 3.1.1.11)

Son enzimas que catalizan la desesterificación de los grupos metilo de la pectina, dando lugar a ácido poligalacturónico o pectato (Kashyap et al., 2001). Su actividad se puede determinar midiendo la liberación de metanol. Las PME, catalizan la desmetilación del grupo carboxilo en la posición C-6, de los restos de ácido galacturónico de las pectinas de alto peso molecular, lo que conlleva a la eliminación de los grupos metilo de los galacturonanos esterificados.

De la bibliografía se deduce, que la eliminación de los grupos metilo incrementa el acceso a los polisacáridos del enzima PG, resultando en la interrupción del gel péctico (Barnavon et al., 2001). Varios autores establecieron que los niveles de PME son muy altos en frutos inmaduros y disminuyen hasta poco antes de la maduración. Esta correlación negativa, entre los niveles de esta enzima y el grado de maduración, es empleada por algunos investigadores como indicador del tiempo que falta para que el fruto madure (Nemecek-Marshall et al., 1995).

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2.2.5.2. Enzimas despolimerizantes o despolimerasas

Se clasifican atendiendo a tres aspectos, que se refieren al modo de ataque al esqueleto del ácido poligalacturónico, y siguen los siguientes criterios:

a) El mecanismo químico de ruptura de los enlaces: hidrólisis o transeliminación. b) La naturaleza del sustrato preferido: pectina o ácido poligalacturónico.

c) El modo de corte del polímero: endo o exo (Alkorta et al., 1998) (Tabla 4).

Los enzimas despolimerizantes pueden romper los enlaces α-(1→4) glucosídicos, entre los monómeros de ácido galacturónico de las pectinas, por hidrólisis (hidrolasas) o por transeliminación (liasas).

• Hidrolasas: Estos enzimas, rompen los enlaces entre los monómeros de ácido galacturónico por adición de agua. Son activas a pH ácido y pueden ser inhibidas por el ión calcio (Guevara et al., 1997). Se pueden dividir en dos grupos principales atendiendo al sustrato que hidrolizan:

- Poligalacturonasas (PG) o pectato hidrolasas

Las PG degradan la pectina desmetilada, es decir, el ácido poligalacturónico o pectato. Pueden tener modo de acción endo o exo. La endo-PG actúa al azar a lo largo de la cadena, lo que se traduce en una acusada disminución de la viscosidad del sustrato para un bajo nivel de actividad. La exo-PG cataliza la ruptura hidrolítica de enlace α-(1→4) terminal de la cadena de galacturonano, liberando ácido galacturónico como producto de reacción. A diferencia de la endo-PG, la exo-PG también escinde el ácido digalacturónico.

La PG está implicada en el ablandamiento de los frutos durante la maduración. El aumento de la solubilidad de las pectinas durante este proceso se puede deber, principalmente, a la despolimerización de las pectinas por la acción de esta enzima (Lohani et al., 2004).

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- Polimetilgalacturonasas o pectin hidrolasas

Estos enzimas degradan el polímero metilado, la pectina. Aunque hay algunas publicaciones que describen este tipo de actividad catalítica, la existencia de estos enzimas parece ser cuestionada, pues es posible que preparaciones de poligalacturonasas contaminadas con pectinesterasas, hayan sido consideradas por error como preparaciones de polimetilgalacturonasas (Alkorta et al., 1998). • Liasas: Estos enzimas, también llamadas transeliminasas, rompen los enlaces

glucosídicos por β-eliminación en presencia de Ca2+, obteniéndose una molécula de pectina de menor grado de polimerización, con un extremo reductor, y otra en cuyo extremo no reductor, se genera un doble enlace entre los C4 y C5. Según el sustrato sobre el que actúen, sea pectina o ácido poligalacturónico, se clasifican en polimetilgalacturonato liasas o poligalacturonato liasas, respectivamente. Estos enzimas debilitan las estructuras de la pared celular en láminas paralelas, afectando principalmente a la lámina media (Amrani- Joutei et

al., 2003).

- Poligalacturonato liasas o pectato liasas (PcL)

Las PcL, catalizan la ruptura de las uniones glicosídicas entre moléculas de ácido galacturónico no metiladas, en pectinas de baja metoxilación. Es Ca2+ dependiente, y puede actuar tanto al azar como en posición terminal (Whitaker, 1990). Estos enzimas actúan a pH alcalino, entre 8 y 10, y pueden tener modo de acción endo o exo (Sakai et al., 1993).

- Pectín liasas (PL)

Son enzimas, que catalizan la ruptura de los enlaces en sustratos altamente esterificados. Actúan al azar, no habiéndose identificado ninguna PL que pueda escindir el enlace terminal (Ros, 1989).

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2.2.5.3. Protopectinasas

Según Sakai et al. (1993), son enzimas que solubilizan la protopectina, y se clasifican en dos tipos. El tipo A degrada el ácido poligalacturónico de la protopectina, mientras que el tipo B degrada las cadenas de polisacáridos que conectan el ácido poligalacturónico con otros constituyentes de la pared celular. En este tipo de enzimas se incluirían las hidrolasas y liasas que degradan el ramnogalacturonano (De Vries y Visser, 2001).