• Cuatro campanas flujo laminar con superficie calefactada y sistema de CO2 (K-SYSTEMS
Kivex Biotec. Ltd., Noruega) acopladas a un microscopio estereoscópico Nikon (Nikon Corp., Japón). Esta zona fue destinada a la manipulación de gametos, embriones y preparación de las placas de cultivo.
• Cinco incubadoras G185 Long term flat bed (K-SYSTEMS Kivex Biotec Ltd., Noruega). Se destinaron a la incubación de ovocitos y cultivo de embriones hasta el estadio de blastocisto. El propio incubador lleva integrado un mezclador de CO2 y N2 con un
suministro conectado de dichos gases.
• Tres microscopios invertidos Nikon TE 2000S y Nikon Eclipse Ti (NIKON Corp., Japón) con superficie calefactada (Tokai Hit Thermo Plate, OLYMPUS Corp., Japón) acoplados a microinyectores Narishige (NARISHIGE Corp., Japón), donde se realizó la selección de espermatozoides e ICSI.
• Microscopio invertido DIAPHOT 200 (NIKON Corp., Japón) con superficie calefactada (Tokai Hit Thermo Plate, OLYMPUS Corp., Japón). Se utilizó para la valoración morfológica de óvulos y embriones.
• Pipetas automáticas de distinto calibrado (GILSON, Francia; EPPENDORF, Alemania). • Controladores de temperatura y concentración de CO2 (LABOTECT Gmbh Labor-Technik,
Göttingen, Alemania). Se utilizaron para realizar el control diario de las temperaturas y CO2 de las incubadoras.
• Torres con filtros CODA (GEN X International, América) para la filtración de posibles compuestos volátiles en el área del laboratorio de FIV.
• Banco de vapores de nitrógeno líquido CBS V1500-AB Isothermal Freezer (CUSTOM BIOGENIC SYSTEMS©, MI, U.S.A.). Donde se almacenaron todos los embriones criopreservados.
• Dos campanas de flujo laminar horizontal TELSTAR V-100 (TELSTAR Grupo, Barcelona) con microscopio invertido NIKON TMS-F (NIKON Corp., Japón). En esta zona se realizó la valoración espermática y el procesado de muestras seminales.
• Tres centrifugas KUBOTA 2420 (KUBOTA Corp., Japón). Se utilizaron para la capacitación y lavado de las muestras espermáticas.
• Banco de N2 líquido ARPEGE 170 (AIR LIQUIDE Medicinal S.L., Madrid). Donde se
almacenaron las muestras criopreservadas de los pacientes y donantes de semen. • Microscopio de campo claro LEICA DMS 750 (LEICA Microsystems, Alemania). Se utilizó
para la visualización de la morfología espermática.
• Contador de células LEUCOFORM (CRISON Instruments, S.A., Barcelona). Se usó para el recuento de espermatozoides durante el contaje de la morfología espermática. • Nevera THERMOLABIL (LIEBHERR, Alemania) para el mantenimiento de medios de
cultivo y crioprotectores.
• Pipetas automáticas de distinto calibrado (GILSON, Francia; EPPENDORF, Alemania). Por último, se contó con un programa informático gestionado por Ginefiv, donde quedó registrada toda la información relacionada con cada paciente. Este sistema se utilizó para reportar todos los datos de las historias clínicas incluidas en el diseño de este trabajo.
1.2.
SELECCIÓN DE PACIENTES
Los datos analizados en este trabajo correspondieron a un estudio realizado en la clínica Ginefiv S.L, de forma prospectiva y no randomizada, entre el 1 de enero de 2012 y el 31 de septiembre de 2015.Se incluyeron 662 pacientes que llevaron sus embriones a día +5 o +6 de cultivo embrionario (cultivo largo) generando 2898 embriones en estado de blastocisto que, o bien se transfirieron ese mismo ciclo, o bien se vitrificaron para futuros tratamientos.
Los pacientes que llevaron sus embriones a cultivo largo fueron aquellos que:
• Tuvieron ciclos previos con fallos de implantación. Con el cultivo largo se pudo observar el desarrollo embrionario hasta día +5 o +6 y, de esta manera, comprobar que el embrión no se bloqueó durante los primeros días de desarrollo y fue capaz de llegar a blastocisto.
• Pacientes en las que se deben evitar las gestaciones múltiples (patologías ginecológica que lo impidan) transfiriendo un único embrión. Se considera que un embrión en este estadio tiene mayor tasa de implantación que un embrión en día +3 de desarrollo.
• Pacientes del programa de DGP. La biopsia embrionaria se realiza en día +3 y el embrión permanece en el laboratorio hasta día +5, día que se conoce el resultado del análisis.
• Pacientes que tienen un número elevado de embriones en día +3 de desarrollo. No todos los embriones van a ser capaces de llegar a este estadio, por tanto, solo contaremos con aquellos que sí llegaron, mejorando la selección y, reduciendo así, el número de embriones que se deben criopreservar. A lo largo de este trabajo se quiere dejar constancia que, se referirá a “preembrion” siempre que se use el término “embrión” de acuerdo con la ley 14/2006 de 26 de Mayo, sobre técnicas de reproducción asistida que, lo define como “el embrión in vitro constituido por el grupo de células resultantes de la división progresiva del ovocito desde que es fecundado hasta 14 días más tarde”.
PACIENTES CON OVOCITOS PROPIOS
La fecundación in vitro con ICSI en este grupo de estudio, estuvo indicada cuando la paciente presentó patología tubárica, endometriosis, fallo de inseminación artificial, factor masculino, esterilidad de origen desconocido, fallo ovárico y/o disminución de la reservaPara ello, las pacientes tuvieron que someterse a una estimulación ovárica cuyo objetivo fue: • Obtener una respuesta suprafisiológica, aumentando así ́ el número de ovocitos y embriones disponibles para seleccionar el día de la transferencia, favoreciendo en definitiva, las tasas de embarazo. • Evitar picos espontáneos y prematuros de hormona luteínizante (LH). • Disminuir las complicaciones derivadas de estos procedimientos. Según los protocolos establecidos por Ginefiv las pacientes se clasificaron en: • Altas respondedoras: pacientes menores de 30 años, con un recuento de folículos antrales (RFA) mayor de 15 folículos en ecografía basal, criterios de ovarios poliquísticos (PCOS) según los Criterios Internacionales de Rotterdam, hormona antimulleriana (AMH) mayor de 3 ng/ml y/o antecedentes de síndrome de hiperestimulación ovárica (SHO) en ciclos previos.
• Normo respondedoras: pacientes menores de 38 años, con un RFA menor de 12 folículos en ecografía basal, AMH entre 1,2 y 3 ng/ml, hormona folículo estimulante (FSH) menor de 10 UI/l, índice de masa corporal (IMC) no extremo (<35 kg/m2), sin
diagnóstico de PCOS y sin respuesta anómala previa.
• Bajas respondedoras: pacientes qué según los criterios internacionales del Consenso de Bologna 2011 (87), cumplieron al menos dos de las siguientes tres características: • Edad materna avanzada (≥ 40 años). • Baja respuesta en ciclos previos (≤ 3 ovocitos con un protocolo de estimulación convencional). • Reserva ovárica anormal: • RFA < 5-7 folículos en ecografía basal. • AMH < 0.5-1.1 ng/ml.
Todas las pacientes, además de haber sido sometidas a una estimulación ovárica controlada, también se sometieron a una preparación endometrial mediante la administración