Eritrocito como modelo de membrana

El eritrocito representa un modelo celular muy simple (no contiene ni núcleo ni orgánulos), fácilmente disponible y manejable y, a pesar de que les falta la maquinaria de síntesis proteica y que son menos especializados que muchas otras células, sus membranas desarrollan suficientes funciones en común con ellas, como el transporte activo y pasivo y la producción de gradientes iónicos y eléctricos (Svetina y col., 2004; Kleszczynska y col., 2005; Suwaslsky y col., 2009). Además, su falta de núcleo le priva de los mecanismos de protección propios de otras células para luchar frente a las agresiones sobre la membrana (Jones, 1992). Por lo tanto, la membrana del eritrocito puede ser considerada representativa de las membranas plasmáticas celulares en general, además de constituir un buen modelo para el estudio de la interacción de sustancias bioactivas con las membranas celulares. Estas observaciones parecen ser la razón del gran número de estudios publicados que se basan en la actividad hemolítica de diferentes tensioactivos (Vives y col., 1999; Dufour y col., 2005; Rasia y col., 2007; Sánchez y col., 2007a; Suwaslsky y col., 2009).

La lisis de la membrana celular por tensioactivos es un proceso de gran importancia y por eso se han realizado muchas investigaciones al respecto, con el objetivo de entender el mecanismo subyacente a ese proceso (Shalel y col., 2002). El mecanismo involucrado en la interacción de compuestos bioactivos con las membranas celulares es un proceso muy complejo que todavía no es totalmente conocido (Dufour y col., 2005; Martínez y col., 2007; Sánchez y col., 2007a; Preté y col., 2011). Por lo tanto, son necesarios estudios específicos para alcanzar un conocimiento profundo de estos mecanismos. El uso del eritrocito como modelos de membrana permite la valoración de alteraciones en la célula y, por lo tanto, de características específicas de la bicapa lipídica, como cambios en la fluidez y deformidad, cambios en la morfología, fragmentación y degradación de proteínas que llevan a la ruptura de la membrana (Figura 9) (Srour y col., 2000; Sánchez y col., 2007a). Una definición de todos estos procesos puede, a su vez, permitir la comprensión de los mecanismos involucrados en la interacción de compuestos bioactivos con

membranas celulares. Cabe destacar que, teniendo en cuenta sus múltiples propiedades, los tensioactivos pueden constituir excipientes bioactivos eficaces cuando se incorporan en vehículos nanoestructurados destinados a la encapsulación y liberación de moléculas biológicamente activas. El conocimiento de las propiedades específicas de cómo cada sistema tensioactivo interacciona con la membrana puede tener un papel clave para ampliar su rango de aplicaciones biomédicas.

Figura 9. Principales alteraciones producidas en el eritrocito por exposición a compuestos bioactivos como los tensioactivos.

Entre los mecanismos sugeridos como base de la lisis celular provocada por los tensioactivos, se puede destacar la solubilización de la membrana y la lisis osmótica (Bielawski, 1990; Jones, 1999). Generalmente se asume que a concentraciones suficientemente elevadas, el principal mecanismo de lisis celular es la solubilización de los lípidos y proteínas de la membrana debido a la formación de micelas mixtas (Jones, 1999). A concentraciones bajas, el principal resultado de la incorporación de los tensioactivos en la membrana, es un cambio en su permeabilidad, que provoca penetración de agua, hinchazón de la célula y lisis de la membrana (Bielawski, 1990). Teniendo en cuenta la complejidad de estos mecanismos, se han propuesto una variedad de ensayos para estudiar la interacción de compuestos químicos con las membranas celulares, utilizando el eritrocito como modelo de membrana:

Eritrocitos

Cambios en las proteínas de membrana Hemólisis Cambios morfológicos Cambios en la fluidez difusión lateral flip-flop flexión rotación flip-flop Complejo de unión Filamento de espectrina Bicapa Lipídica Proteína Banda 3 Membrana celular

• Ensayo de hemólisis

El ensayo de hemólisis es un método sencillo, barato, no se necesita un equipamiento sofisticado y requiere poco tiempo por producto. Además está bien caracterizado ya que los criterios principales de valoración están bien definidos. El ensayo se basa en el potencial de una sustancia química para perturbar las membranas celulares, valorando espectrofotométricamente la liberación de hemoglobina de una suspensión de eritrocitos incubada con la sustancia a ensayar y bajo condiciones estándar. Además de la utilización del ensayo de hemólisis para la evaluación del potencial efecto irritante inducido por tensioactivos (Mitjans y col., 2003; Benavides y col., 2004b; Martínez y col., 2006; Sánchez y col., 2006a), este ensayo se utiliza también para la valoración de tensioactivos y polímeros que tienen la habilidad de interaccionar con las membranas celulares de manera sensible a cambios de pH (Chen y col., 2005, 2009; Wang y col., 2007).

La hemólisis en medio hipotónico, conocida como antihemólisis, también es una técnica muy utilizada en el estudio de la interacción de compuestos bioactivos con membranas celulares (Stasiuk y col., 2004; Kleszczynska y col., 2005; Sánchez y col., 2007a; Arias y col., 2010). Este método permite valorar los cambios inducidos por los tensioactivos en la resistencia osmótica de la célula y, por lo tanto, su grado de protección frente la hemólisis hipotónica. La comprensión de estos fenómenos permite el establecimiento de algunos mecanismos involucrados en la interacción de los tensioactivos con las membranas celulares, como el nivel de incorporación en la bicapa lipídica y los cambios en el volumen y/o área superficial de la célula (Isomaa y col., 1986; Abe y col., 1991; Miseta y col., 1995; Dufour y col., 2005; Sánchez y col., 2007a).

• Evaluación de la fluidez de membrana por anisotropía de fluorescencia

La fluidez de la membrana es un parámetro importante relacionado con su estructura y estado funcional (Shinitzky y Barenholz, 1978). El estudio de la fluidez permite determinar la localización de los compuestos en la bicapa lipídica y sus efectos en la dinámica de lípidos en diferentes regiones de la membrana (Martínez y col., 2007; Marczak, 2009). Se estudia mediante anisotropía de fluorescencia que, utilizando sondas fluorescentes capaces de localizarse en regiones específicas de la bicapa lipídica, permite caracterizar la influencia de diferentes moléculas bioactivas en las propiedades biofísicas de las membranas (Arora y col., 2000; Hou y col., 2011). La incorporación de tensioactivos en la membrana altera significativamente sus características funcionales y, dependiendo de la magnitud de esta interacción, estos compuestos bioactivos pueden alterar la permeabilidad de la membrana por

inducción de cambios en el orden, orientación y fluidez de los lípidos (Xia y Onyuksel, 2000).

• Análisis de las proteínas de membrana por electroforesis en gel de poliacrilamida

En la membrana de los eritrocitos, la bicapa lipídica está anclada en una red de proteínas esqueléticas a través de proteínas transmembrana. La Banda 3, la principal proteína integral de membrana, interacciona con este citoesqueleto que mayoritariamente incluye espectrina, actina, anquirina y proteína 4.1 (Fairbanks y col., 1971). La organización de esta red proteica, en particular en la superficie más interna de la membrana, es la responsable de mantener la forma, estabilidad y deformidad de los eritrocitos (Vittori y col., 2002). Las alteraciones en el patrón proteico se observan mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida (SDS-PAGE, en sus siglas en inglés) (Silva y col., 2000; Rossi y col., 2006; Hou y col., 2011). El patrón de bandas permite determinar si los tensioactivos inducen degradación o cualquier alteración de las proteínas de membrana. Se puede establecer si el daño en la integridad proteica de la membrana es un mecanismo involucrado en el proceso de interacción de los compuestos bioactivos con la membrana celular.

• Observaciones de la morfología del eritrocito por microscopía electrónica de barrido

La interacción y/o incorporación de compuestos bioactivos en la bicapa lipídica conduce a alteraciones en la rigidez y forma de la membrana celular. El estudio de la morfología celular por microscopía electrónica de barrido (SEM, en sus siglas en inglés) permite observar los cambios morfológicos inducidos por los tensioactivos (Vives y col., 1999; Dubnicková y col., 2000; Rasia y col., 2007). Las diferencias en la perturbación de la membrana, debido al intercalado o partición de los tensioactivos en la bicapa fosfolipídica, permiten comprobar el grado de interacción de estos compuestos con la membrana. De acuerdo con la hipótesis de la bicapa lipídica (Sheetz y Singer, 1974; Lim y col., 2002) los cambios de morfología inducidos en los eritrocitos por moléculas extrañas se deben a expansiones diferenciales de las dos monocapas de la membrana. Según esta hipótesis, los equinocitos se formarían cuando los compuestos se insertan en la monocapa más externa de la bicapa (por lo tanto, el área de esta capa se incrementaría respecto a la capa interna), mientras que los estomatocitos, eritrocitos que presentan una morfología un poco redondeada, con forma de copa, se formarían cuando los compuestos se insertaran en la monocapa interna (Figura 10). Por último, la formación de esferocitos seria debida al aumento del intercalado del tensioactivo tanto en la

monocapa externa como en la monocapa interna de la membrana (Vermehren y Hansen, 1998; Suwalsky y col., 2005).

Figura 10. Representación esquemática de la hipótesis de la bicapa lipídica (Adaptada de Sheetz y Singer, 1974; Vermehren y Hansen, 1998).

3.2. Eritrocito como modelo de membrana del endosoma: valoración de