Escherichia coli aislada de materia fecal de cerdos sanos

1_{Rabe, Erica;}1_{Patalano, Claudio;}2_{González, Agustina;}2_{Casabonne, Cecilia;}2_{Aquili, Virginia;}1_Cerrutti, Jorgelina

1_{Cátedra de Farmacología y Terapéutica. Facultad de Ciencias Veterinarias.}2_{Área Bacteriología. Facultad}

de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR) [email protected] Los antimicrobianos (ATM) se utilizan en animales de producción con fines profilácticos, terapéuticos y como promotores del crecimiento ejerciéndose, de esta manera, una presión de selección de bacterias resistentes de origen animal, no solo en bacterias patógenas sino también en las comensales que se convierten en reservorio de genes de resistencia a distintos ATM4. La colistina (COL) es un antibiótico del grupo de las polimixinas descubierto en la década del 40 para el tratamiento de las infecciones por gramnegativos. Después de varios años de uso clínico en humanos, su popularidad disminuyó debido a su toxicidad renal y neurológica. En cerdos, la COL es usada solo por vía oral ya que no se absorbe por dicha vía y se evita así su toxicidad; es de primera elección para el tratamiento de diarreas por Escherichia coli (E. coli) y Salmonella spp4. En los últimos años, éste antibiótico ha resurgido en Medicina Humana como una opción de tratamiento de última línea para los organismos gramnegativos resistentes a múltiples antimicrobianos, incluyendo carbapenemes. Hasta hace unos años, la resistencia adquirida a la COL era rara y principalmente debido a mutaciones en los genes cromosómicos. Recientemente, se detectó el gen mcr-1 (Mobile Colistin Resistance) productor de una enzima responsable de la resistencia de las bacterias a este antibiótico. El gen mcr-1 es de codificación plasmídica, por lo que las bacterias pueden compartir y diseminar fácilmente la resistencia a otras bacterias mediante transferencia horizontal. A partir de estos hallazgos, se han ido reportando en varios países la aparición de enterobacterias portadoras del gen mcr-13. En nuestra zona, es común el uso preventivo de COL en la dieta de lechones recién destetados. En ese sentido, es urgente que el uso de este antibiótico sea limitado únicamente al tratamiento de animales afectados clínicamente y se prohíba su uso como profilaxis o promotor del crecimiento bajo el principio de uso responsable de los ATM. Con base en los actuales reportes de la detección de cepas de enterobacterias portadoras del gen mcr-1 se han emitido las correspondientes alertas epidemiológicas por parte de la Organización Panamericana de la Salud (OPS) en conjunto con la Organización Mundial de la Salud (OMS). Por estas razones, resultó de interés la detección fenotípica de cepas de enterobacterias con resistencia a colistina, junto con la tipificación molecular. Un fenómeno adicional importante a estudiar en nuestros sistemas productivos porcinos es la co-selección de genes de resistencia por lo que se estudió en esta primera etapa también la sensibilidad a otros ATM. Se estudiaron muestras de materia fecal recolectadas por hisopado anal a 5 lechones destetados de 4 semanas de edad alojados en el Módulo Productivo Porcino de la Facultad de Ciencias Veterinarias. Los cerdos estaban alimentados con una dieta a base de maíz, pellet de soja y 30% de la premezcla Recría 300 AP de Bioter® que contiene sulfato de colistina al 10% entre sus componentes Se procedió al cultivo de las muestras de materia fecal en Levine a 37°C en aerobiosis durante 24 h y posteriormente se realizaron las pruebas bioquímicas metabólicas para la identificación de E. coli. En las cepas identificadas como E. coli se determinó si correspondían a algunos de los virotipos patógenos mediante la detección de los genes de virulencia que caracterizan a cada uno de dichos virotipos. Se determinó la sensibilidad a COL mediante la técnica de pre-difusión con discos(Rosco diagnostica®)2. Luego, a los aislamientos que resultaron intermedios o resistentes según esta técnica se les determinó la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) empleando el equipo Vitek 2C (método de microdilución). Por último, se realizó la detección del gen mcr-1 por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) a aquellos aislamientos que presentaron una CIM > 2ug/ml2_{. Además, se estudió la sensibilidad a los}

antimicrobianos por el método de difusión en agar (Método de Kirby- Bauer) utilizando discos de papel impregnados en antibióticos de acuerdo a las normas del Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI). Se probaron los siguientes antibacterianos: enrofloxacina (ENR), florfenicol (FFL), gentamicina (GEN), ceftiofur (CEFT) y trimetoprima/sulfametoxazol (TMS). Se utilizó como control la cepa E. coli ATCC 25922. Los resultados de las pruebas bioquímicas permitieron caracterizar fenotípicamente aislamientos de E. coli, aunque mediante tipificación molecular, estas cepas no se correspondieron con los virotipos patógenos descriptos en E. coli. La sensibilidad a los ATM se presenta en la siguiente Tabla: todas las cepas fueron sensibles a GEN; el porcentaje de cepas resistentes (R) a los distintos ATM fueron: 22% TMS, 22% a ENR, 11% a CEFT, 55% a FFL. En el caso del COL, el 33% de las cepas fueron R y el 22% presentó sensibilidad intermedia (I) mediante el ensayo de pre-difusión.

XVIII Jornadas de Divulgación Técnico-Científicas 2017. Facultad de Ciencias Veterinarias. V Jornada Latinoamericana III Jornadas de Ciencia y Tecnología 2017. Facultad de Ciencias Agrarias. II Reunión Transdisciplinaria en Ciencias

Agropecuarias 2017, Universidad Nacional de Rosario. Casilda y Zavalla, 12 y 13 de septiembre de 2017

80 Tabla: Sensibilidad a diferentes ATM de cepas de E coli

Cepas* GEN TMS ENR CFTIO FFC COL _COLCIM

(ug/ml) gen mcr-1 1ª S S R S R R 4 detectable 1b S S S S S S - - 3a S S S S R S - - 3b S S S S R S - - 4a S R R R R S - - 4b S R S S R R 8 detectable 5a S S S S S R 8 detectable 5b S S S S S I 3 detectable 5c S S S S S I 8 detectable

(*N° identifica animal; letras identifica cepa aisladas de ese animal)

El perfil de sensibilidad antimicrobiana fenotípica en E. coli de la flora normal muestra relación en general con la frecuencia de uso de estas drogas en el Módulo Productivo Porcino. Los aminoglucósidos y TMS no son utilizados nunca, el caso de las sulfas por la prohibición del SENASA. El 22% de R a TMS podría manifestar un fenómeno de co-selección de resistencia. Los ATM más comúnmente utilizados en el Modulo son FFC, ENR y CFTIO, coincidente con la aparición de resistencia. La resistencia a fluorquinolonas mediante alteraciones de permeabilidad en la membrana o la activación de bombas de eflujo son algunas mutaciones que confieren resistencia también a otros ATM. Se ha reportado la inducción de resistencia a cefalosporinas, tetraciclinas, ampicilina y TMS por el uso de ENR en porcinos1. Con respecto a la COL, la detección fenotípica de cepas resistentes y la posterior detección del gen mcr-1 en algunos aislamientos de E. coli estarían indicando la necesidad de continuar estos estudios y alertar sobre la adopción de medidas urgentes que retrasen o eviten la diseminación de bacterias resistentes a COL, siendo considerado un ATM de importancia crítica para Medicina Humana. Se debe tener en cuenta que estos animales estaban comiendo una dieta con colistina desde los 15 días de vida aproximadamente y que esta práctica es muy común en nuestro medio productivo.

BIBLIOGRAFÍA

1. Béraud R, Huneault L, Bernier D, Beaudry F, Letellier A, del Castillo J. Comparison of the selection of antimicrobial resistance in fecal Escherichia coli during enrofloxacin administration with a local drug delivery system or with intramuscular injections in a swine model. The Canadian Journal of Veterinary Research 2008;72:311–319

2. Boyen, F. Vangroenweghe, P. Butaye, E. De Graef, F. Castryck, P. Heylen, M. Vanrobaeys, F. Haesebrouck (2010). Disk prediffusion is a reliable method for testing colistin susceptibility in porcine E. coli strains. Vet Microbiol.; 144(3-4): 359–362. Published online 2010 Jan 28. doi: 10.1016/j.vetmic.2010.01.010

3. Rhouma M, F Beaudry, W Thériault, A Letellier (2016). Colistin in Pig Production: chemistry, mechanism of antibacterial action, microbial resistance emergence, and one health perspectives. Frontiers in Microbiology. Published: 11-2016 doi: 10.3389/fmicb.2016.01789.

4. Shryock, T. Page, P.W (2013). Performance Uses of Antimicrobial Agents and Non-antimicrobial Alternatives. In: Antimicrobial Therapy in Veterinary Medicine Fifth Edition. Giguere, S. Dowling, P. Prescott, J. (eds.) Wiley-Blackwell, (USA) pp. 379 - 394.

Descripción clínico patológica de un brote de polioencefalomalacia en terneros

asociado a altos contenidos de azufre en el agua de bebida

Riganti, Juan Guido

Cátedra de Patología Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de Rosario (UNR) [email protected]

La polioencefalomalacia de los rumiantes (PEM), también conocida como necrosis cerebrocortical, es una enfermedad neurológica no infecciosa frecuente de los bovinos y ovinos. Los animales de todas las edades pueden verse afectados, pero los animales jóvenes son los más susceptibles1. Varios factores de riesgo como la deficiencia de tiamina, la toxicidad por azufre, la toxicidad de plomo y la privación de agua-toxicidad por sodio han sido implicados en el desarrollo de PEM. Todos estos factores producen lesiones cerebrales similares. Independientemente de la sospecha de causa de PEM, los animales afectados con frecuencia responden a la administración de tiamina; por esta razón, se cree comúnmente que la deficiencia de tiamina es un importante factor metabólico implicado en la patogénesis de la PEM. La toxicidad del azufre es cada vez más aceptada como una de las principales causas de PEM y hay numerosos trabajos que indican que niveles de azufre dietéticos superiores al 0,45% en la materia seca (MS) causan PEM clínica y experimental1_{. El objetivo de este trabajo es presentar los hallazgos clínicos y patológicos de un brote de}

PEM en terneros de feed lot con altos valores de azufre en el agua de bebida. El problema se presentó en un establecimiento dedicado al engorde a corral de terneros con un stock de 2.000 animales ubicado en la localidad de General Roca, en el sur de la provincia de Córdoba, en la estación de verano, con días de temperaturas que alcanzaban los 35ºC. Se realizó el examen clínico de animales afectados y la necropsia de dos animales recién muertos con sintomatología nerviosa; tras la inspección post mortem se tomaron muestras de cerebro y cerebelo, hígado, riñón, intestino y pulmón, fueron acondicionadas en formol al 10% para estudios histopatológicos. Se remitieron muestras de cerebro para análisis microbiológicos. Se colectaron muestras de agua de los pozos (dos) y de la mezcla de los mismos del tanque para estudios de calidad química por técnicas de titulación, turbidimetría y gravimetría. Diez animales murieron en un periodo de 15 días y 7 presentaban signos nerviosos el día de la visita. La sintomatología observada fue principalmente de tipo nerviosa, en grados variables; en estadios tempranos de la enfermedad los signos fueron intermitentes, incluyendo incoordinación, aparente ceguera, presión craneal, opistótonos, y en estadios finales, decúbito y convulsiones. La temperatura y movimientos ruminales fueron normales. Los terneros generalmente mueren en uno o dos días luego de presentados los síntomas. Los animales tenían buena condición corporal y en la necropsia no se observaron lesiones macroscópicas de significancia. El ph ruminal fue de 6. Los hallazgos histopatológicos significativos se observaron en el cerebro y consistieron en degeneración y necrosis de las neuronas corticales laminares superficiales a medias, caracterizadas por retracción y aumento de la acidofilia del citoplasma, picnosis nuclear y leve rarefacción aislada del neurópilo adyacente, con diagnóstico final de necrosis cortical; además, leve hipertrofia multifocal de las células endoteliales capilares, aumento del espacio de Virchow-Robbins y escasos macrófagos alrededor de los vasos sanguíneos. No se aislaron agentes bacterianos en las muestras de cerebro, las improntas de cerebro fueron negativas para el virus de la rinotraqueitis infecciosa bovina en pruebas de inmunofluorescencia. Los resultados bioquímicos del agua de bebida más significativos fueron: sales totales en rangos de 4.500 a 6.680 ppm y una elevada concentración de sulfatos (por turbidimetría) con valores de 5.819 ppm, 3.255 ppm y la mezcla de agua de los pozos dio 4.700 ppm de sulfatos. Los síntomas clínicos y las lesiones microscópicas son indicativas de un cuadro de polioencefalomalacia asociada a una elevada ingesta de azufre. En los bovinos en engorde a corral, este proceso, generalmente, se asocia a acidosis metabólica provocada por dietas ricas en carbohidratos y pobres en fibra, que originan la proliferación de la flora amilolítica, en detrimento de la celulolítica, además estas bacterias producen tiaminasas destruyendo la tiamina ingerida en la ración, y por otro van a inhibir la síntesis de tiamina en rumen (tiaminasas hidrolasas) exacerbando el proceso. El NRC (1996), en dietas para bovinos de carne, recomienda niveles de azufre dietario de aproximadamente 0,15% de la materia seca con un máximo tolerable de 0,4% de la MS3. La mezcla de agua de los pozos dio 4.700 ppm de sulfatos y un novillito a corral puede consumir aproximadamente del 10 al 18% de su peso en agua con temperatura de 20ºC y de más de 30ºC respectivamente lo que indicaría una alta ingesta de azufre, por lo cual la cantidad que esta estarían consumiendo los animales superaría esto niveles a los que se le suman los del alimento. Se ha estimado que concentraciones de azufre en el agua sobre las 2.000 ppm, en ambientes de temperatura moderada, pueden resultar en una ingesta total de azufre en la dieta de hasta 0,53% con presentación de casos clínicos de PEM2. Gould et al. (1997) informaron que en novillos expuestos a altos niveles de azufre en el agua potable (3400 ppm de sulfato) presentaron lesiones de polioencefalomalacia. El azufre dietético es normalmente reducido a sulfuro en el rumen por las bacterias ruminales y aunque los mecanismos por el cual el exceso de azufre produce PEM no están bien conocidos, se piensa que su conversión a sulfuro lo hace un potente tóxico que afecta al sistema nervioso central; puede deprimir los centros respiratorios del cerebro causando anoxia tisular y disminución del ATP por bloqueo de la actividad de la citocromo oxidasa. Algunos autores mencionan un efecto indirecto de los sulfuros mediante la interferencia en la producción de

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tiamina2. Otro mecanismo señalado para el daño neurológico es vía la formación de radicales libres provenientes de aniones sulfurosos con capacidades destructivas de tejidos similares a la de los radicales hidroxilos1. La calidad del agua es un factor clave en la producción y la salud animal. Como medidas de control, en los establecimientos de riesgo, se deberían realizar mediciones periódicas de las concentraciones de azufre en el agua ya que estas podrían sobrepasar los límites tolerables y de esta forma asegurar una dieta balanceada sin exceso de azufre.

BIBLIOGRAFÍA

1. Gould, D. H., Cummings, B. A. y Hamar, D. W. (1997). In vivo indicators of pathologic ruminal sulfide production in steers with diet-induced polioencephalomalacia. Journal Veterinary Diagnostic Investigation, 9, 72-77.

2. Gould, D. H., McAllister, M. M., Savage, J. C. y Hamar, D. W. (1991). High sulfide concentrations in rumen fluid associated with nutritionally induced polioencephalomalacia in calves. American Journal Veterinary Research, 52 (7), 1164-1169.

3. National Research Council, Nutrient Requirements of Beef Cattle. (1996)National Academy Press, Washington DC, 204-213.

Determinación de la concentración de solutos en orinas de pacientes caninos:

comparación de osmometría versus densidad urinaria (refractometría y tiras

reactivas)

1,2_{Rodriguez, Joaquín Valentín;}1_{Colla, Cora;}1_{Gines, Melina Beatriz;}1_{Schröder, Gisel}

1_{Laboratorio Centralizado Hospital Escuela de Grandes y Pequeños Animales (HEGYPA). Facultad de}

Ciencias Veterinarias. 2Centro Binacional de Investigaciones en Criobiología Clínica y Aplicada (CAIC), Universidad Nacional de Rosario (UNR) [email protected]

Para estimar la concentración de solutos en orina existen dos métodos, 1- la osmometría (OSM) (considerada la técnica de referencia)4 y 2- la determinación de la densidad urinaria (DU), equivalente al Peso Específico en el sistema métrico decimal. Para determinar la DU pueden utilizarse técnicas como la refractometría (RF), la urinometría (densímetro) y las tiras reactivas (TR). En el laboratorio clínico veterinario, debido al pequeño volumen de las muestras de orina se utiliza tradicionalmente la RF, aunque recientemente se ha detectado la tendencia en algunos laboratorios al uso de TR. En la literatura existen controversias acerca de la eficacia de la TR (diseñada para orina humana) respecto de su uso en caninos y felinos2,3. Dada la importancia creciente de la aplicación de las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en los laboratorios clínicos veterinarios es imprescindible estandarizar protocolos de nuestro laboratorio en referencia a la metodología a aplicar en las muestras a analizar. El objetivo del presente estudio preliminar fue: a- valorar la exactitud de la RF y de las TR en la determinación de la DU en orina de caninos comparándolas con el método de referencia la OSM. b- establecer un criterio para la valoración de la DU en las muestras de orina recibidas en nuestro laboratorio. Se analizaron muestras de orina proveniente de pacientes caninos recibidas y procesadas en nuestro laboratorio, se excluyeron las muestras que contenían glucosa y proteínas. Para ello se decidió comparar los resultados obtenidos utilizando 3 metodologías: 1- determinación de la osmolalidad de las muestras mediante la técnica de descenso crioscópico (Osmomat 030, Gonotec), para calibrar el instrumento se utilizaron standards de 300, 850 y 2000 mOsm/KgH2O. 2-

determinación de la DU utilizando un refractómetro clínico Alla France mod. 95000-017 y 3- determinación de la DU utilizando tiras reactivas Siemens Multistix 1056. Se analizaron 16 muestras de orina en las que se determinó la DU por RF y TR y luego conservadas a -20C hasta la det. de OSM. En los casos en que la DU excedió los límites establecidos en el refractómetro (DU > 1.050) y en TR (DU >1.030) las muestras fueron diluídas al medio (1/2) con agua destilada y luego analizadas. Para determinar la DU de la dilución se multiplicó la porción decimal de la nueva lectura por la dilución3, Ej: DU determinada en dil 1/2 =1.020, luego 0.020 x 2 = 0.040 entonces la DU corregida será 1.040. Los resultados mostraron una fuerte correlación entre los valores de la DU determinados por RF y la OSM, (R=0.9908), con una clara tendencia lineal (Fig.1) (R=coeficiente de correlación). También ello sucedió para los valores de DU >1.050 que fueron diluidos. En cambio la correlación entre la DU estimada por TR y la OSM fue muy débil (R=0.4386), mostrando una falta de asociación entre dichas mediciones (Fig.2).

Cuando se correlacionaron los valores de DU determinados por RF y TR se encontró una asociación débil entre ellos (DU-TR = 0.6684 + 0.3429 DU-RF, R=0.37304, n=16) (Fig.3). Estos resultados indican

claramente que las TR no deben utilizarse para estimar la DU en caninos, siendo el método óptimo en

Agropecuarias 2017, Universidad Nacional de Rosario. Casilda y Zavalla, 12 y 13 de septiembre de 2017

84 Fig.3

términos de costos, medición en campo y fiabilidad, la RF. Se estableció entonces el siguiente criterio para la determinación de la DU en muestras de caninos:

1 - centrifugar la orina, 2 - análisis de la muestra por RF, si el valor obtenido es > 1.050, se diluye la muestra al medio con agua destilada, 3- se determina nuevamente la RF, realizando el cálculo correspondiente, 4- se analiza la muestra con TR para determinar el resto de los parámetros bioquímicos y 5- en caso de detectar concentraciones de glucosa o proteínas, realizar las correcciones respectivas1 a la DU determinada por RF.

BIBLIOGRAFÍA

1. Chadha, V., Garg, U., Alon, U.S. (2001). Measurement of urinary concentration: a critical appraisal of methodologies. Pediatr. Nephrol. 16:374-382.

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3. Sink, C.A., Weinstein, N.M. (2012). Chapter 3: Routine Urianalysis: Physical properties. En Urine Practical Veterinary Urinalysis. pag. 23-24. West Sussex, UK: Wiley-Blackwell. ISBN: 978-0-470-95824-7.

Diagnóstico y abducción. Mortalidad en vacas adultas por Leptospira interrogans

In document Libro de resúmenes II Reunión Transdisciplinaria en Ciencias Agropecuarias 2017 (página 81-87)