6.7 Estudios conformacionales
6.7.2 Espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier (FT-IR)
El estudio de la conformación de los péptidos por espectroscopia de infrarrojo, se realiza mediante el estudio de las bandas de absorción producidas por la vibración de los enlaces del grupo amida en el enlace peptídico. Para las proteínas existen siete bandas amida, pero las más importantes y sensibles son la I, II y III. La mayoría de estudios utilizan la banda amida I, que aparece entre 1600 y 1700 cm-1 y que corresponde a la vibración del enlace C=O, C-N y N-H [119]. Como ocurre en la técnica de dicroísmo circular, dependiendo de
Introducción Péptidos de fusión del virus de la hepatitis G
36 la posición de la banda que contiene varios componentes solapados, obtendremos una estructura secundaria distinta. La deconvolución de la banda I es más sencilla que en la técnica de dicroísmo circular porque se pueden aproximar a curvas de tipo Lorentziano o Gaussiano [120]. El análisis permite la obtención de distintas bandas con la posibilidad de calcular la proporción de cada conformación obtenida. Las longitudes de onda en las que aparecen las distintas conformaciones son las siguientes: la estructura desordenada o random coil aparece entre 1640-1650 cm-1; cuando la banda se desplaza a mayor longitud de onda, aparece la hélice α hasta 1660 cm-1; la lámina β se presenta entre 1615-1640 cm-1 con una banda secundaria en 1670-1680 cm-1 y la lámina β antiparalela está centrada aproximadamente en 1630 cm-1; por último el giro β se localiza sobre 1660 cm-1.
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Objetivos Péptidos de fusión del virus de la hepatitis G
38 El objetivo principal de esta tesis se basa en la definición del péptido de fusión del virus de la hepatitis G. Con ese fin, se pretende realizar experimentos biofísicos con diversas regiones peptídicas previamente seleccionadas y sintetizadas utilizando modelos de membrana. Los objetivos concretos encaminados a la consecución del objetivo anterior son los siguientes:
- Selección de secuencias peptídicas de la proteína estructural E2 del virus de la hepatitis G que puedan constituir el péptido de fusión del virus. La selección se realizará siguiendo dos criterios distintos: selección de la zona N-terminal y de alguna zona interna de la proteína que cumpla criterios de fusogenicidad según las escalas semiempíricas (Wimley & White, Kyte & Doolitle entre otros).
- Síntesis manual de los péptidos escogidos siguiendo protocolos en fase sólida. Purificación de las secuencias peptídicas por cromatografía de alta resolución a escala preparativa (HPLC) y caracterización mediante análisis de aminoácidos, espectrometría de masas y HPLC a escala analítica.
- Caracterización fisicoquímica de los péptidos. Estudio de la actividad superficial de los péptidos y de la capacidad de formar monocapas estables mediante la realización de isotermas de compresión.
- Estudios de la interacción de los péptidos con modelos de membrana
monomoleculares. Cinéticas de penetración de los péptidos con monocapas fosfolípidicas. Isotermas de compresión de los fosfolípidos extendidos solos, de fosfolípidos con péptidos en la subfase, o de monocapas mixtas péptido/fosfolípido. - Estudio de la morfología de las películas de los componentes estudiados (péptidos, fosfolípidos o péptido/fosfolípido) por microscopía del ángulo de Brewster (BAM). - Estudio de la interacción de los péptidos con bicapas lipídicas (liposomas)
mediante técnicas biofísicas (calorimetría diferencial de barrido, espectroscopia de fluorescencia, microscopía de transmisión electrónica y espectrometría visible). Realización de experimentos para determinar específicamente si los péptidos tienen propiedades fusogénicas (ensayos de liberación de contenidos vesiculares, de fusión, de agregación y de hemólisis).
- Estudio de la conformación adoptada por los péptidos en distintos medios (acuoso, mimético de membrana y distintos modelos de membrana) mediante las técnicas de dicroísmo circular y espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier, para tratar de establecer una relación entre la estructura de los péptidos y su capacidad de interacción con los modelos de membrana utilizados.
Objetivos Péptidos de fusión del virus de la hepatitis G
39 La realización de estos objetivos se encuentran descritos en los artículos que forman la parte central de la tesis.
Artículo 1 Larios, C., Busquets, M.A., Carilla, J., Alsina, M.A., Haro, I. (2004) Effects of overlapping GBV-C/HGV synthetic peptides on biomembrane models. Langmuir, 20, 11149-11160
Artículo 2 Larios C., Christiaens B., Gómara, M.J., Alsina, M.A. and Haro, I. (2005) Interaction of synthetic peptides corresponding to hepatitis G virus (HGV/GBV-C) E2 structural protein with phospholipid vesicles, FEBS Journal, 272, 2456-2466.
Artículo 3 Larios, C., Casas, J., Alsina, M.A., Mestres, C., Gómara, M.J., and Haro, I., (2005) Characterization of a putative fusogenic sequence in the E2 hepatitis G virus protein, Arch. Biochem. Biophys., 442 (2): 149-159.
Artículo 4 Larios, C., Miñones, J.Jr., Haro, I., Alsina, M.A. and Busquets, M.A., (2005) Study of adsorption, langmuir and penetration into phospholipid monolayers of E2(279-298) peptide, J. Phys. Chem. B, enviado.
En el anexo de la presente tesis se incluyen trabajos que directa o indirectamente han ayudado a conocer las técnicas biofísicas utilizadas. Los trabajos mostrados tienen como objetivo el estudio de las interacciones entre péptidos sintéticos y modelos de membrana. Aunque el estudio que se describe en el artículo del anexo I, no forma parte del tema que se trata en esta tesis, ha tenido utilidad para entrar en contacto con los péptidos sintéticos y sus interacciones con lípidos. El trabajo descrito en el anexo IV, aunque forma parte de la sección de resultados, se ha querido incluir en el anexo debido a que el artículo en cuestión está todavía realizándose.
Anexo 1 Larios, C., Espina, M., Alsina, M.A., and Haro, I. (2004) Interaction of three beta- interferon domains with liposomes and monolayers as model membranes, Biophys. Chem., 11, 123-133
Anexo 2 Larios C., Carilla, J., Busquests, M.A., Alsina, M.A. and Haro, I., (2004) Perturbations induced by synthetic peptides belonging to the E2 structural protein of Hepatitis G virus (GBV-C/HGV) in lipid membranes: a differential scanning calorimetry study, J. Phys. IV, 113, 31-34 .
Anexo 3 Larios, C., Casas, J., Alsina, M.A., Mestres, C., and Haro, I., (2005), Interaction with membrane model systems of synthetic putative fusion peptides derived from hepatitis G virus E2 Protein, Luminiscence, 20, 279-281.
Anexo 4 Larios, C., Miñones J. Jr., Haro, I, Busquets, M.A, Alsina M.A, (2005), Miscibility and Langmuir studies of the interaction of the E2(279-298) peptide sequence of GBV-C/ HGV with DPPC and DMPC phospholipids, en preparación
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