Esquema de criterios direccionales para los ensayos del comportamiento quimiotáctico Las

CCN mesencefálicas migran desde un acúmulo celular (NCCs source) ubicado en el centro del tabique que separa ambos compartimientos, formando un halo de expansión migratoria centrífuga en la condición control o en células que no responden con quimiotaxis (líneas rectas sobre el lado izquierdo). En cambio, bajo condiciones de estímulo quimiotáctico (gradiente de concentración) desde el compartimiento derecho (w2), el desplazamiento celular (prevenido de moverse hacia el acúmulo de células) muestra un patrón de trayectorias con tendencia a migrar hacia el atractante (líneas curvas hacia el lado derecho de la cámara). (Figura tomada de Rovasio et al., 2012).

time-lapse Sony SVT-S3050P (Sony Corp.), procediéndose al registro de la actividad celular durante 6 horas. Luego, una imagen cada 30 minutos fue capturada y digitalizada a lo largo de las 6 horas de registro, con el programa VidCap32 (Microsoft Corporation), procediéndose a analizar los diferentes parámetros en estudio mediante la aplicación de un programa de análisis de imágenes comercial (SigmaScanPro, SPSS Co. EUA), y algoritmos matemáticos desarrollados en nuestro laboratorio (Figs. 8 y 9) (Rovasio y Battiato, 2002; Rovasio et al., 2012).

El análisis de las células del frente de migración (borde del explanto) abarcó la determinación de parámetros morfométricos (área, perímetro y factor de forma) [factor de forma = (4π x área)/perímetro2; el valor de este parámetro de un círculo perfecto es igual a uno, y a medida que el objeto se alarga este valor tiende a cero], parámetros dinámicos absolutos (distancia recorrida, velocidad lineal y curvilineal, y linealidad), y parámetros quimiotácticos (índice quimiotáctico, proporción de células orientadas, ángulo de giro y proporción de trayectorias orientadas, todos ellos en relación al eje del gradiente). Las diferentes formas de evaluar la migración celular orientada en el mismo experimento, mediante criterios de direccionalidad estrictos, permite discriminar efectos dinámicos que podrían no ser aparentes al evaluar solamente uno de los parámetros (Rovasio et al., 2012). En el presente trabajo, los resultados de los diferentes parámetros quimiotácticos evaluados fueron globalmente coherentes y convergentes; en consecuencia, en los diferentes experimentos no se mostrarán necesariamente los resultados de todos los parámetros estudiados a fin de evitar redundancias.

Inmunomarcación

A fin de verificar su pureza, los cultivos de CCN fueron lavados con PBS a TA 2 x 5 min, y fijados con paraformaldehído al 4% a TA durante 10 min, o con metanol frío por 10 min a - 20 ºC. Luego, fueron lavados con PBS a TA 3 x 10 min. Cuando fue necesario, las células fueron permeabilizadas con Tritón X100 0,2% en PBS a TA durante 10 min. Posteriormente, se incubaron con solución de bloqueo (1% de albúmina y 1,5% de glicinaen PBS pH 7) a TA durante 1-3 horas. Sin lavado posterior, los cultivos de CCN fueron incubados con el anticuerpo primario monoclonal HNK-1 marcador de CCN (Vincent et al., 1983) (líquido ascítico de ratón Cat. C-0678, o Ig de ratón Cat. C-6680, Sigma Chem, Co.); o con el anticuerpo policlonal de cabra anti-Ptch1 (cat. SC-6149, Santa Cruz Biotech, Inc.); o con el anticuerpo policlonal de conejo anti-Smo (cat. SC-13943, Santa Cruz Biotech, Inc.) a TA por 4 h (o toda la noche a 4 ºC). Los cultivos se lavaron con solución de bloqueo 3 x 15

min y luego fueron incubados con el anticuerpo secundario Ig de Cabra anti-IgM de ratón- FITC (Cat. F 9259, Sigma Chem Co.) (1/400); o con el anticuerpo secundario de burro anti-Ig cabra-FITC (Alexa Fluor® 488 cat. A-11055, Life technologies) ; o con el anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo-FITC (cat. BT-557, Biomedical BTI) respectivamente, a TA por 3 h. Como control negativo se realizó el mismo procedimiento pero sin el agregado del anticuerpo primario, siendo reemplazado por solución de bloqueo. Luego de lavar con solución de bloqueo 3 x 20 min a TA, los cultivos fueron montados con solución “anti-bleaching” (Molecular Probes, Oregon, EUA) (Fig. 9 A, B).

Fig. 9. Cultivos de CCN cefálicas. A. Microscopía de contraste de fase del halo de migración en un cultivo convencional. B. Cultivo idéntico a A. inmunomarcado para CCN con Ac HNK1. C. y D. Mismo campo de un ensayo de viabilidad (rojo: células muertas; verdes: células vivas; ver detalles en el texto). E. Determinación de proliferación de CCN por incorporación de BrdU.

A

B

D

C

Determinación del trofismo celular

Viabilidad/citotoxicidad

Para estos experimentos se usó el método de calceína-etidio Live/Dead Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), siguiendo las instrucciones de los fabricantes, basado en la determinación simultánea de: (1) la actividad de esterasas intracelulares en células vivas, que clivan las moléculas de Calceína AM (no fluorescente y permeable a las membranas plasmáticas) a calceína (= fluorescencia verde y retenida dentro del citoplasma); y (2) la integridad de la membrana celular con Etidio H-1, que aumenta su fluorescencia cuando se une los ácidos nucleicos de células muertas (= fluorescencia roja) (Fig. 9 C, D). Brevemente, los cultivos de CCN fueron lavados con PBS a 37 ºC. Luego de retirar el PBS, se agregó 100 µl de Etidio 4 µM + Calceína 2 µM en PBS, y se incubó por 10-15 min a 37 ºC en atmósfera húmeda. Sobre un portaobjetos se colocó una gota de PBS y el cubreobjetos con el cultivo invertido, llevándose a un microscopio con filtros de fluorescencia adecuados. Las condiciones experimentales de estos ensayos, se detallan en la sección Resultados. Las células fueron registradas dentro de los 15 minutos, abarcando campos parcialmente superpuestos de todo el cultivo a fin de recombinarlos como explantos enteros para su posterior análisis y cuantificación. Las mismas preparaciones fueron registradas por contraste de fase y por fluorescencia (Fig. 9 C, D). El armado digital de los explantos se realizó con el programa Adobe Photoshop CS2. Sobre las imágenes en contraste de fase se dibujaron áreas circulares concéntricas con el programa Image J 1.44 (NIH, Bethesda, USA), abarcando el halo de migración de las CCN. Posteriormente, se trasladó esa grilla a la imagen de la misma preparación en fluorescencia, y se procedió al recuento semi-automático de las células (Fig. 9 C, D).

Proliferación

Se utilizó una adaptación del método de la Bromo-deoxi-Uridina (BrdU) (Soriano y Del Río, 1991). Brevemente, en cada cápsula de cultivo conteniendo 1,8 ml de medio, se agregó 200 µl de solución de BrdU [concentración final: 10µM], incubándose por 3 h a 37 ºC y 5% CO2. Luego de lavar con PBS a TA, el cultivo fue fijado con paraformaldehído 4% en

PBS por 10 min a TA, con posterior lavado con PBS por 3 min y permeabilización con Tritón X-100 al 0,2% en PBS por 10 min a TA. Se lavó con PBS por 3 min a TA y se denaturalizó el ADN con HCl 2N durante 2 h a TA. Luego de lavar 2 x 5 min en buffer borato 0,1M a pH 8,5 y a TA, la preparación fue lavada con solución de bloqueo 3 x 5 min, incubándose con el

anticuerpo monoclonal anti-BrdU (Sigma Chem. Co.) durante 20 h a TA. Se lavó con solución de bloqueo 3 x 10 min a TA y se incubó con anticuerpo secundario de conejo anti- IgM de ratón (Sigma Chem. Co.) durante 1 h a 37 ºC. Al lavado final con solución de bloqueo por 3 min a TA, siguió el montaje con anti-“bleaching” (Fig. 9 E). Las células fueron registradas por contraste de fase y en fluorescencia, abarcando campos parcialmente superpuestos de todo el cultivo a fin de recombinarlos como explantos enteros para su posterior análisis y cuantificación. El armado digital de los explantos se realizó con el programa Adobe Photoshop CS2. Luego, sobre las imágenes en contraste de fase se dibujaron áreas circulares concéntricas con el programa Image-J 1.44 (NIH, Bethesda, USA), abarcando el halo de migración de las CCN. Posteriormente, se superpusieron las imágenes de los canales (contraste de fase y fluorescencia) para formar una sola imagen y se procedió al recuento semi-automático de las células de forma similar a los tratamientos de viabilidad/citotoxicidad. (Fig. 9 C, D)

Transfección in vitro de CCN utilizando Endo-Porter®

Para transfectar CCN in vitro con morfolinos utilizamos el sistema Endo-Porter®, (Gene Tools, LLC Philomath, USA) que consiste de moléculas peptídicas especialmente diseñadas para inducir endocitosis y entregar dentro del citoplasma celular las moléculas deseadas. Este sistema es ideal para incorporar moléculas como péptidos, proteínas pequeñas, anticuerpos y oligonucleótidos antisentido como los morfolinos. Sin embargo, no es efectivo para la transfección ADN plasmídico. El sistema Endo-Porter tiene la ventaja de no ser tóxico y no generar daños en las membranas celulares de las células receptoras. En nuestro sistema experimental lo utilizamos para transfectar cultivos de CCN in vitro para su posterior análisis en la cámara de quimiotaxis mediante video-microscopia.

En este trabajo, utilizamos una concentración final de 1 μM de morfolino marcado con Lisamina (sulforodamina B) dirigido contra el ARNm de Smo (5’- AAAGCAGCAGCTCACCATGCTCCAT-3’ sulforodamina B), o 1 μM de morfolino estándar control marcado con carboxifluoresceina (5'-CCTCTTACCTCA GTTACAATTTATA-3' carboxifluoresceina), ambos con el agregado de 5 μl de Endo- Porter por cada 1 ml de medio de cultivo suplementado 10 % de suero, incubándose por 24 horas. Posteriormente, se reemplazó el medio de cultivo con medio definido y las

células fueron utilizadas en diferentes ensayos. En experimentos preliminares y para evaluar la transfección de los morfolinos mediante fluorescencia, utilizamos una concentración final de 10 μM, posteriormente se ajustó la concentración para el análisis experimental a 1 μM como se mencionó anteriormente (ver Fig. 32 en la sección Resultados).