Establecimiento de las uniones estrechas

Como bien se mencionó en la introducción las uniones estrechas son fundamentales en el establecimiento y mantención de la asimetría basal-apical que es clave en la polarización de las células epiteliales y en la adquisición del fenotipo diferenciado. Para poder visualizar si existía formación de uniones estrechas se evaluó por inmunofluorescencia la distribución de la glicoproteína gp135, un marcador apical ampliamente utilizado para células MDCK (Meder et al., 2005) y la proteína citoplasmática ZO-1, que interacciona con las proteínas integrales ocludina y claudina, proteínas clave en la formación de las uniones estrechas (Mitic et al., 2000) en un cultivo de células MDCK cultivadas con 0,5% de SFB en presencia y en ausencia (células control) del inhibidor L-tDHS por 72 horas. En los paneles se puede visualizar la distribución del marcador gp135 (fluorescencia roja) y de la proteína ZO-1 (fluorescencia verde).

En la Figura 41 A se esquematizan secciones de 0,5 μm desde el plano más basal hacia el plano más apical de la monocapa de células (representación gráfica). En la Figura 41 B se observa que en células control la gp135 puede visualizarse desde todos los planos focales con una distribución tanto lateral como superior ocupando toda la membrana celular (7 µm). Esta distribución se visualiza más claramente en la magnificación de una sola célula (recuadro blanco) en donde la intensidad de señal (fluorescencia roja) es más fuerte en los planos inferiores (a-g) y menos intensa en los planos superiores (h-j). Por otra parte la proteína ZO-1 posee una distribución intracelular en forma de vesículas que se observa en todos los planos focales de la monocapa.

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Figura 41. Seccionamiento óptico de las células MDCK y análisis de la distribución de las proteínas ZO-1 y gp-135 tanto en la condición control como en células tratadas con L-tDHS por 72 hs. (A) Representación gráfica del seccionamiento óptico en distintos planos focales. (B) y (C) Inmunofluorescencias realizadas con doble marcación: en verde la proteína ZO-1 y en rojo el marcador apical gp135 tanto para la condición control como para células tratadas con L-tDHS por 72 hs. Reconstrucciones 3D y del eje Z obtenidos a partir del seccionamiento óptico.

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Las fotos correspondientes a la superposición de las imágenes verdes y rojas no muestran colocalización de ambas señales fluorescentes. Esto se evidencia a través de los índices de Pearson. El índice de pearson es un parámetro cuantitativo que indica colocalización cuando los valores son superiores a 0,75. En todos los planos analizados vemos que los valores son inferiores a 0,2, lo que indica ausencia de colocalización. Las reconstrucciones 3D y del eje Z fueron realizadas como se describe en la sección materiales y métodos y pseudocoloreadas en rojo para gp135 y en verde para ZO-1, de modo de mantener el patrón de colores analizado en los paneles anteriormente descriptos. La imagen de la reconstrucción 3D evidencia a la proteína gp135 distribuida a lo largo de toda la membrana celular y en algunas células también observamos que se encuentra en la zona superior de la misma. A su vez la proteína ZO-1 se observa como puntos intracelulares aislados. La reconstrucción del eje Z, donde se observa las células de perfil, muestra fuerte intensidad de señal fluorescente roja en los bordes laterales y más débil en el borde superior. Esto sugiere que la proteína gp135 presenta una localización homogénea en la membrana plasmática, ocupando aproximadamente 7 um de espesor, medida que coincide con la altura de estas células.

En la Figura 41 C se observa que en células tratadas con L-tDHS por 72 hs se producen cambios sustanciales en la distribución de la gp135 (señal fluorescente roja) y también de la ZO-1 (señal fluorescente verde), dónde se puede visualizar claramente que la proteína ZO-1 presenta una fuerte intensidad de señal hacia los bordes laterales que es evidente en los planos inferiores (planos a-c) disminuyendo significativamente hacia los planos superiores (c-f) y visualizándose claramente en la magnificación de una sola célula (recuadro blanco). Para el caso de la proteína gp135 se observa señal fluorescente positiva desde los cortes inferiores pero de muy baja intensidad (a-c) incrementándose hasta hacerse muy intensa en los planos superiores (d-f). En la reconstrucción 3D se puede apreciar con mayor detalle a la proteína ZO-1 distribuida en los bordes celulares laterales (2 µm) y a diferencia de la proteína gp135 que aparece prácticamente confinada en el borde superior (4 µm). Tampoco se observa al igual que en las células control colocalización de ambas señales fluorescentes. Por otro lado en la Figura a de la reconstrucción del eje Z se puede observar a la proteína ZO-1 circunscripta como puntos verdes fluorescentes intensos en el borde lateral, en cambio el marcador apical gp135 se localiza exiguamente en el borde lateral (señal de fluorescencia roja tenue) y esta señal se intensifica llegando al borde superior (flechas blancas). En la

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Figura b correspondiente a los planos superiores se ve en mayor detalle la localización de gp135 circunscripta al borde superior y a la proteína ZO-1 bien focalizada en puntos verdes fluorescentes bien intensos tal como se había descripto en la anterior Figura y reforzando lo visualizado en la reconstrucción 3D. A modo de resumen en células tratadas con L-tDHS por 72 hs se puede observar un esbozo de delimitación entre un borde apical, dónde encuentra distribuido solo el marcador apical de células MDCK gp135 y un esbozo de borde lateral dónde se encuentra confinada la proteína ZO-1, a diferencia de las células control dónde el marcador gp-135 se encuentra en el borde lateral y difuso en el borde superior y dónde la proteína ZO-1 se encuentra en forma de vesículas citoplasmáticas sin formar parte de las uniones intercelulares. Esta delimitación vista en células tratadas con L-tDHS en dos bordes celulares bien definidos (uno apical y otro lateral) en donde se encuentran distribuidas estas proteínas es característico en la formación una unión estrecha madura, reflejando un mayor grado de diferenciación celular.