Otro de los principales resultados obtenidos en nuestro estudio ha sido la correlación entre el estilo de vida de las bacterias y el factor sigma54.¿Por qué se favorece el factor sigma54 en especies bacterianas de vida libre? La molécula ppGpp (guanosina tetrafosfato) es una regulador global emisario de condiciones restrictivas de estrés del medio (Laurie et al, 2003). Se ha visto que su acción está estrechamente relacionada con el factor sigma54 (Powell & Court, 1998; Van Dien & Victor de Lorenzo, 2003; Bernardo et al, 2006; Szalewska-Palasz et al, 2007).
Cuando una bacteria entra en fase estacionaria, o cuando hay condiciones de estrés en el medio, ppGpp se une a su cofactor DksA (con capacidad de unión a la RNAp), con el objetivo de regular negativamente los promotores dependientes de sigma70 (Paul et al, 2005). Se estima que durante la fase de crecimiento exponencial, la transcripción desde promotores dependientes de sigma70 ocupa entre el 60 y el 70% de la maquinaria transcripcional (Bremen & Dennis, 1996). Este hecho indica que durante este periodo, existen menos núcleos de RNAp libres. Al incrementar la síntesis de ppGpp, se reduce la vida de los complejos activos de las holoenzimas formadas por la RNAp y el factor sigma70 e incrementan los núcleos libres de RNAp que podrán unirse al factor sigma54.
5. Discusión
Además, ppGpp regula los niveles de IHF (Shingler, 2003). Ya hemos comentado en la introducción que la proteína IHF interviene como soporte estructural para mejorar el contacto entre la holoenzima RNAp-sigma54 unida al ADN en las posiciones -12/-24 y la proteína activadora sujeta a las UAS (Hoover et al, 1990; Pérez-Martín et al, 1994).
Otra de las funciones de IHF es evitar la promiscuidad de los promotores sigma54 con otros EBPs; Pérez-Martín & de Lorenzo (1995) proponen un efecto restrictivo de IHF sobre la flexibilidad de la región que alberga un promotor sigma54, en el promotor Pu del plásmido TOL de Pseudomonas
putida. La rigidez en la conformación del ADN, provocada por la
presencia de IHF, serviría para incrementar la especificidad de la activación del mecanismo de iniciación de la transcripción dependiente de sigma54.
Posteriormente, Bertoni et al (1998) demostraron que la unión de IHF estimulaba directamente, con independencia a la acción de los EBPs, la unión de la holenzima con el promotor -12/-24 gracias a la interacción entre el dominio C-terminal de la subunidad α de la RNAp, con secuencias de DNA específicas (similares a los elementos UP) situadas en posición corriente arriba del sitio IHF. Esta unión adicional incrementaría la afinidad del promotor Pu hacia la holoenzima RNAp-sigma54.
Santero et al (1992) sugirieron que los promotores sigma54 de baja afinidad se inducían mediante IHF, asegurándose una correcta activación por parte del activador específico y desfavoreciendo la unión de otros activadores. Nuestros resultados nos indican que existe un elevado número de promotores sigma54 de baja afinidad. Relacionando nuestro trabajo con los previamente mencionados, sugerimos que los genes dependientes de promotores sigma54 de baja afinidad se aseguran la correcta activación de su mecanismo de transcripción de modo específico por su EBP gracias a la acción de IHF. La intervención de IHF dotaría al sistema sigma54 de otro punto de control para ganar especificidad y restrictividad en la activación
5. Discusión
del mecanismo, compensando, en cierto modo, la baja afinidad de un promotor sigma54 con respecto a la holoenzima.
La transcripción desde promotores sigma54 de baja afinidad ganaría en robustez y especificidad con la acción de IHF. Esta hipótesis podría complementarse con la del punto 5.3.2, donde hipotetizábamos una selección de los promotores sigma54 de baja afinidad debido a un ahorro energético para sintetizar la cantidad mínima de proteína para realizar una función.
La correlación entre ppGpp, IHF y el sistema sigma54 explicaría por qué el mecanismo de iniciación de la transcripción dependiente de sigma54 se ve favorecido en especies de vida libre. Como ya hemos descrito previamente, los ambientes de vida libre presentan más cambios que los habitados por bacterias asociadas a un hospedador, con fuentes constantes de nutrientes y condiciones fisiológicas más estables. Las bacterias de vida libre sintetizarán más ppGpp debido a que frecuentan más situaciones de estrés que las asociadas a un hospedador; por ello, el factor sigma54 se verá favorecido en estas especies. En estas condiciones de estrés, las bacterias de vida libre amplifican sus sistemas sigma54.
La complejidad del sistema sigma54 reside en el conjunto de dispositivos de regulación que proporcionan un estricto control del sistema para obtener una robusta transcripción de los genes que configuran el sigmulón sigma54 de cada organismo. La suma de plasticidad y conexión con el estado fisiológico del medio que rodea una bacteria indican que cada bacteria habría intentado ajustar su sistema sigma54, al igual que muchos otros mecanismos de regulación (como hemos referenciado en la introducción), a sus necesidades fisiológicas para poder adaptarse a un medio determinado. Estas necesidades diferirían según la bacteria y según el nicho, por ello, los mecanismos de regulación presentarían una conservación tan baja. Así, cada microorganismo habría desarrollado sus
5. Discusión
propias interacciones entre sus factores de transcripción y sus genes diana, para su óptima adaptación al estado fisiológico que le rodea.
6. Conclusiones
A partir del trabajo presentado en esta tesis doctoral, concluimos que:
1. Hemos detectado la presencia del gen rpoN y el número de promotores sigma54, genes dependientes de sigma54 y proteínas EBPs predichos en un número elevado de bacterias, en lo que hemos denominado análisis de la distribución del sistema sigma54. De este análisis podemos concluir:
(i) Los componentes del sistema sigma54 presentan una amplia distribución filogenética; sin embargo, esta distribución es muy heterogénea, incluso entre especies próximas.
(ii) Los organismos de vida libre contienen más promotores sigma54, operones dependientes de sigma54 más largos y un mayor número de EBPs que los organismos asociados a un organismo. Por ello, el número de componentes del sistema sigma54 se ve favorecido en especies de vida libre.
2. Hemos analizado la composición del sigmulón sigma54 en las distintas especies.
(i) Existe una pobre conservación de los promotores sigma54 entre las distintas especies.
(ii) Un elevado número de genes dependientes de sigma54 no presentan genes ortólogos, lo que sugiere que estos genes son relativamente nuevos y han adquirido el mecanismo de iniciación de la transcripción dependiente de sigma54.
(iii) El sistema sigma54 presenta una gran diversidad en la función de sus genes; además, estas funciones son específicas de cada especie bacteriana.
6. Conclusiones
3. La regulación de genes dependientes de sigma54 se correlaciona específicamente con el estilo de vida de las bacterias. Genes relacionados con el flagelo son dependientes de sigma54 exclusivamente en especies de vida libre.
4. Existe un mayor número de promotores sigma54 de afinidad baja y alta; además, grupos de genes ortólogos conservan sus promotores sigma54 de alta y baja afinidad. En cambio, existe un número inferior de promotores sigma54 de afinidad intermedia, que no se conservan en grupos de genes ortólogos. Esta distribución de la afinidad de los promotores sigma54 podría tener implicaciones evolutivas con la optimización de la síntesis de proteínas.
5. Las secuencias de unión de los EBPs se conservan en un reducido grupo de genes ortólogos. A pesar de su complejidad, el mecanismo de activación de sigma54 permite variaciones tanto en sus sitios de unión, como en su modo acción, lo que demuestra la plasticidad de los regulones sigma54.
La proximidad de un EBP y su gen diana podría determinar la conservación de la interacción entre ambos.
6. El sistema de iniciación de la transcripción dependiente de sigma54 representa un dispositivo de regulación para controlar, de modo estricto y específico, la activación de genes para la óptima adaptación al estado fisiológico que rodea una bacteria.
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