Estado Social de Derecho en las reformas estructurales

V práci boli použité dva typy vzoriek humínových látok, komerčne dostupný štandard humínových kyselín (HK) od firmy Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Co, St. Louis. MO, USA (Aldrich)) a humínové kyseliny izolova- né z pôdy (Hroboňovo, okres Dunajská Streda (DS J)) použitím modifikovanej IHSS frakcionačnej schémy14,15_.

Roztoky vzoriek HL boli pripravené denne, rozpustením tuhých vzoriek HK vo fosforečnanovom tlmivom roztoku, o koncentrácii približne 3 mg ml1, miernym pridaním 0,05M NaOH bolo dosiahnuté takmer úplne rozpustenie naváženej vzorky. Takto pripravené roztoky boli pred chromatografickou analýzou centrifugované na centrifuge (JANETZKI T30, Lipsko, Nemecko) při otáčkách 3000 min1 po dobu 5 min.

Chemikálie

Organickým modifikátorom mobilnej fázy bol N,N- dimetylformamid DMF (Merck, Darmstadt, Germany). Tlmivá zložka mobilnej fázy (5mM NaH2PO4) bola pripra-

vená rozpustením prislušného množstva soli v deionizovanej vode (Labconco, Kansas City, USA), pH pripraveného roztoku bolo upravené pridávaním 5mM roztoku kyseliny fosforečnej (Merck, Darmstadt, Germa- ny) na požadovanú hodnotu (3.00).

RP-HPLC metóda

Na frakcionáciu a charakterizáciu vzoriek HL bol použitý HPLC systém LaChrom (Merck-Hitachi, Dar- mstadt, Germany), pozostávajúci zo štvorkanálovej pumpy L-7100 on-line spojenou s vákuovým odplyňovačom L- 7612, automatického dávkovača L-7200, kolónového ter- mostatu L-7300, v ktorom bola umiestnená chromatogra- fická kolóna LiChrospher ODS WP 300 RP-

18 250 x 4 mm, veľkosť častíc 5 µm (priemerná veľkosť pórov 30 nm) s predkolónou LiChrospher ODS WP 300 RP-18 4 x 4 mm, spektrofotometrického detektora s radom diód (DAD) L-7450A, flourimetrického detektora (FLD) L-7480. Komunikácia medzi zariadením a riadiacím sof- tvérom HSM verzia 4 bola zabezpečená fázovým rozhra- ním D-7000. Prietok mobilnej fázy bol nastavený na 1.00 ml min1. Teplota kolónového termostatu bola nastavená na 35.0 ± 0.1 °C.

Elúcia skokovým gradientom

Priebeh elúcie skokovým gradientom bol nastavený miešaním roztokov A (1% DMF / 99% fosforečnanový tlmivý roztok (c = 5 mM, pH = 3.00) (v/v)) a B (99% DMF / 1% fosforečnanový tlmivý roztok (c = 5 mM, pH = 3.00) (v/v)) nasledovne: od 0.0 po 3.6 minút izokratický úsek 0% (v/v) B v A, následne od 3.7 minút, bol nastavený každú 4 minútu skok pozostávajúci z 10% (v/v) zvýšenia množstva B v A až po posledný skok pozostávajúci zo zvýšenia o 9% (v/v) a končiaci na 99%, (v/v) B v A a do 55 minúty izokratický úsek 99% (v/v) množstva B v A a od 55.1 minút do 60 minút pokračoval lineárny úbytok z 99% (v/v) B v A do 0% (v/v) B v A. Medzi meraniami bol zaradený 10 minútový časový úsek na re-ekvilibráciu12,13_.

Elúcia lineárnym gradientom

Priebeh elúcie lineárnym gradientom bol nastavený nasledovne: od 0.0 po 5.0 minút izokratický úsek 0 % (v/ v) B v A, následne od 5.1 do 35.0 minút lineárny nárast z 0 % (v/v) B v A do 99 % (v/v) B v A, od 35.1 do 40.0 minúty izokratický úsek 99 % (v/v) B v A, po čom nasle- doval od 40.1 do 45.0 minúty lineárny úbytok z 99 % (v/v) B v A po 0 % (v/v) B v A. Medzi meraniami bol zaradený 10 minútový časový úsek na re-ekvilibráciu12_.

Objem vzoriek dávkovaných do chromatografického systému automatickým dávkovačom boli 300 µl v prípade lineárnej gradientovej elúcie, respektíve 400 µl v prípade skokovej gradientovej elúcie. (podrobnosti viď priložené záznamy). Rozsah snímaných vlnových dĺžok prostredníc- tvom DAD detektora bol nastavený na interval od 260 po 800 nm, keďže samotný DMF absorbuje žiarenie v UV oblasti do 260 nm (cit.12_{). Monitorovacia vlnová dĺžka}

bola nastavená na 280 nm. Parametre fluorometrického detektora boli nastavené nasledovne: excitačná vlnová dĺžka bola 470 nm a emisná vlnová dĺžka bola nastavená na 530 nm.

Výsledky a diskusia

V prvom kroku bola použitá RP-HPLC12,13 _{metóda so}

skokovou gradientovou elúciou na frakcionáciu vzoriek humínových kyselín pre potreby následných experimentov a na charakterizáciu skúmaných vzoriek humínových ky- selín na základe dosiahnutých elučných profilov (obr. 1 a 2). Zo záznamov je zrejmé, že v dôsledku skokovej gra-

dientovej elúcie sa vzorky rozdelili do 11 dobre definova- teľných zón (frakcii). Jednotlivé frakcie boli zozbierané v oblasti maxima píku a ich objem predstavoval 1,2 ml. Takto zozbierané frakcie boli následne analyzované v druhom kroku. Pri porovnaní získaných chromatogra- mov vzoriek HK DS J a HK Aldrich si môžme všimnúť niekoľko odlišností, čo poukazuje na kvalitatívne rozdiely v štruktúre skúmaných humínových kyselín. Najvýraznej- šie sa to prejavuje pri porovnaní píkov eluujúcich v oblasti mŕtveho objemu systému. V prípade HK DS J sa na zá- zname objavil výrazný pík v spomínanej oblasti, čo pouka- zuje na vylúčenie istého množstva vzorky, ktorá za daných podmienok poskytuje fluorescenčný signál s výraznou intenzitou, zatiaľ čo v prípade vzorky HK Aldrich môžeme pozorovať výrazne menší pík v danej oblasti, čo vypovedá o vylúčení menšieho množstva vzorky alebo vylúčená časť vzorky poskytuje fluorescenčný signál výrazne nižšej in- tenzity. Tento jav nadobúda miernejšie kontúry, keď sa do systému dávkuje menší objem vzorky, v prípade dávkova- nia 100 µl bol rozdiel v plochách píkov už iba 10 násobný. Podobný priebeh sme pozorovali pri vyhodnotení chroma- togramov získaných DAD detekciou pri vlnovej dĺžke 280 nm. Tento jav poukazuje na pravdepodobne nedosta- točnú kapacitu použitej kolóny pre dávkovanie príliš veľ- kých objemov relatívne koncentrovaných vzoriek HL, hoci ďalšie pokusy smerované k optimalizácii dávkovaného objemu vzorky preukázali, že dávkovaný objem neovplyv- ní tvar chromatografického záznamu konkrétnej vzorky okrem píku vylúčeného v oblasti mŕtveho objemu systé- mu. Na druhej strane výsledky experimentov zamerané na analýzu zozbieraných frakcií opätovným dávkovaním do chromatografického systému poukazujú na to, že aj malá miera rozmerovej diskriminácie ako v prípade HK Aldrich prináša podobný vplyv na tvar chromatografického zázna- mu vylúčených frakcií ako zdanlivo vysoká miera diskri- minácie v príprade HK DS J.

Taktiež sú badateľné rozdiely v rozložení jednotli- vých frakcií oboch vzoriek. Na chromatografickom zázna-

Obr. 1. RP-HPLC profil vzorky HK DS J (3.02 mg ml1) získa- ný elúciou skokovým gradientom, použitím detekcie FLD (ex. 470 nm, em. 530 nm), bez odčítania pozadia, davkovaný ob- jem 400 µl. Arabské číslice 111 reprezentujú poradie a počet zozbieraných frakcií

me HK DS J môžeme pozorovať, že HL eluujúce v predných frakciách (2,3,4) poskytujú fluorescenčý signál s vyššou intenzitou ako HL prítomné vo frakciách eluujú- cich pri vyššých retenčných časoch. Oproti tomu v prípade vzorky HK Aldrich poskytujú fluorescenčný signál s najvyššou intenzitou HL eluujúce vo frakciách 6,7.

Pre účely charakterizácie RP-HPLC frakcií skúma- ných vzoriek sme použili frakcie zozbierané z pokusov, kde sme dávkovali 400 µl vzorky, nakoľko v prípade dáv- kovaní menších objemov boli výsledky RP-HPLC analýzy zozbieraných frakcií ťažko interpretovateľné v dôsledku prílišného zriedenia vzorky.

V druhom kroku bola RP-HPLC metóda so skokovou gradientovou elúciou použitá na charakterizáciu zozbiera- ných frakcií, ktoré boli reinjektované do toho istého sepa- račného systému (obr. 3 a 4). Zo získaných chromatogra- fických záznamov vyplýva, že reinjektované frakcie oboch vzoriek si zachovali svoj charakter aj po opätovnom ná- streku do chromatografického systému. Výnimku tvorili

prvé frakcie oboch vzoriek, ktoré po opätovnom nástreku do separačného systému poskytli chromatografický zá- znam kopírujúci priebeh separácie pôvodných vzoriek HL analyzovaných v prvom kroku (obr. 1 a 2). Z tohoto dôvo- du môžeme predpokladať, že táto frakcia pravdepodobne obsahuje HL prítomné vo všetkých ostatných frakciách. Na druhej strane sa pri opätovnom nástreku zozbieraných frakcii do chromatografického systému na všetkých zázna- moch objavil pík v oblasti mŕtveho objemu, ktorého plo- cha narastala so zvyšujúcim sa poradím frakcií. Podobný trend môžeme pozorovať aj na záznamoch získaných DAD detekciou napr. pri vlnovej dĺžke 280 nm.

Ďalej bola vypracovaná RP-HPLC metóda s lineárnou gradientovou elúciou, ktorá bola použitá na charakterizáciu získaných frakcií vzoriek skúmaných HK v prvom kroku a takisto pôvodných vzoriek HK Aldrich a HK DS J. Použitím tejto metódy sme získali chromato- grafické záznamy typické pre HK pri použití techniky lineárnej gradientovej elúcie s charakteristickými širokými zónami. Zo získaných chromatografických záznamov vy- plýva (obr. 5 a 6), že maximá píkov jednotlivých RP- HPLC frakcií sa posúvajú k vyšším retenčným časom v poradí frakcií od 2 do 11. Tento fakt nám umožňuje predpokladať, že skúmané frakcie HK aj po opätovnom dávkovaní nemenia svoju charakter a ich retenčné charak- teristiky zostávajú rovnaké bez ohľadu na spôsobe použitej elučnej techniky. Podobne, ako v prípade analýzy frakcií skokovou gradientovou eluciou, aj v tomto prípade objavi- li na zaznamoch píky v oblasti mŕtveho objemu systému. V tomto prípade ale zvyšujúca tendencia plôch píkov so zvyšujúcim sa poradím frakcií neplatí, ako v prípade sko- kového gradientu, ale má náhodný charakter.

Výsledky naznačujú, že použitá 10 skoková gradien- tová elúcia môže indukovať zreteľné črty na chromatogra- fickom zázname humínových kyselín a koncentruje ich do presne vymedzených zón. Kombinácia vhodných solvatač- ných vlastností DMF pre HL a použitie širokopórovej Obr. 2. RP-HPLC profil vzorky HK Aldrich (3 mg ml1_{) získa-}

ný elúciou skokovým gradientom, použitím detekcie FLD (ex. 470 nm, em. 530 nm), bez odčítania pozadia, davkovaný ob- jem 400 µl

Obr. 3. RP-HPLC profily frakcií vzorky HK DS J, získané elúciou skokovým gradientom, po odčítaní pozadia, použitím FLD detekcie (ex. 470 nm, em. 530 nm), dávkovaný objem 400 µl

Obr. 4. RP-HPLC profily frakcií vzorky HK Aldrich, získané elúciou skokovým gradientom, po odčítaní pozadia, použitím FLD detekcie (ex. 470 nm, em. 530 nm), dávkovaný objem 400 µl

(wide-pore) RP stacionárnej fázy zlepšuje povrchové inter- akcie analytov a potláča vplyv efektu rozmerovej diskrimi- nácie. Taktiež poskytuje dobrú reprodukovateľnosť získa- ných chromatografických profilov a dáva predpoklad pre dosiahnutie robustnej analytickej metódy na charakterizá- ciu HL.

Použitá gradientová RP-HPLC metóda má potenciál v kombinácii s inými hlavne separačnými metódami, na účinnú charakterizáciu vzoriek HL. Individuálne frakcie, získané RP-HPLC metódou, môžu byť ďalej analyzované separačnými metódami, založenými na rozdielnych sepa- račných princípoch a mechanizmoch, čím umožňujú do- siahnúť ortogonálne separačné systémy, ktoré poskytujú rozšírený súbor dát s vyššou dimenzionalitou o skúmaných vzorkách HL.

Záver

Získané údaje naznačujú, že takýto model aplikácie nami navrhnutého RP-HPLC systému môže byť vhodný ako separačný systém pre detailnejšiu charakterizáciu komplikovaných prírodných makromolekúl, medzi ktoré patria aj analyzované humínové kyseliny. Dosiahnuté vý- sledky poukazujú na fakt, že získané frakcie skúmaných vzoriek humínových kyselín zachovávajú svoj charakter aj po opätovnom vstupe do separačného systému.

Táto práca vznikla za finančnej podpory projektov VEGA 1/0870/09, APVV-0595-07 a VVCE-0070-07.

LITERATÚRA

1. Hayes M.H.B., MacCarthy P., Malcolm R.L., Switt R.S. (ed.): Search of Structure, Humic Substances, Vol. II, Wiley, New York 1989.

2. Reemtsmaa T., Thesea A., Springer A., Linscheidb M.: Water Res. 42, 63 (2008).

3. Laborda F., Bolea E., Górriz M. P., Martín-Ruiz M. P., Ruiz-Beguería S., Castillo J. R.: Anal. Chim. Acta

606, 1 (2008).

4. Emmenegger Ch., Reinhardt A., Hueglin Ch., Zenobi R., Kalberer M.: Environ. Sci. Technol. 41, 2473 (2007).

5. Jánoš P., J. Chromatogr. A 983, 1 (2003).

6. Abbt-Braun G., Lankes U., Frimmel F. H.: Aquat. Sci.

66, 151(2004).

7. Góra R.: Symposium „Advances in Chromatography and Electrophoresis“ Chirnal 2010, 8.-11.2. Olomouc, (plenary lecture).

8. Whelan T.J., Shalliker R.A., McIntyre C., Wilson M.A.: Ind. Eng. Chem. Res. 44, 3229 (2005).

9. Tatar E., Csintalan E., Mihucz V.G.: J. Microchem.

73, 11 (2002).

10. Trubetskoj O.A., Trubetskaya O.E.: Eurasian Soil Sci.

37, 1170 (2004).

11. Trubetskoj O.A., Trubetskaya O.E., Saiz-Jimenez C.: Eurasian Soil Sci. 38, 1183 (2005).

12. Hutta M., Góra R., J. Chromatogr., A 1012, 67 (2003). 13. Góra R., Hutta M., J. Chromatogr., A 1084, 39 (2005). 14. Kandráč J., Hutta M., Foltin M.: J. Radioanal. Nucl.

Chem., Articles 208, 577 (1996).

15. Prochácková T., Góra R., Kandráč J., Hutta M.: J. Radioanal. Nucl. Chem. 229, 61 (1998).

Obr. 5. RP-HPLC profily frakcií vzorky HK DS J získané elúciou lineárnym gradientom po odčítaní pozadia, použitím FLD detekcie (ex. 470 nm, em. 530 nm), dávkovaný objem 300 µl

Obr. 6. RP-HPLC profily frakcií vzorky HK Aldrich získané elúciou lineárnym gradientom po odčítaní pozadia, použitím FLD detekcie (ex. 470 nm, em. 530 nm), dávkovaný objem 300 µl