Estructura cuaternaria

La estructura cuaternaria de la m-calpaína en ausencia de unión de iones de Ca2+ es compacta (Figura 4). El dominio II, donde reside la actividad hidrolítica, presenta los dos subdominios (IIa y IIb) con una hendidura de unión a substrato entre ellos, mientras que los residuos de la tríada catalítica permanecen separados por más de 10 Å. El domi- nio I interactúa con el VI y el III con el IIb, lo que estabiliza la conformación del núcleo proteolítico. Los dominios IV y VI, a través de la interacción de sus extremos carboxiter- minales, mantienen la asociación de las dos subunidades. La conformación del dominio V es móvil por lo que su estructura cristalina no es observable. La estructura de la µ- calpaína, dadas las similitudes entre ambas proteínas, es asumida como muy similar a la de la m-calpaína (Goll et al., 2003; Suzuki et al., 2004).

3.3.

REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD FISIOLÓGICA

Las calpaínas fueron descritas como proteasas dependientes de Ca2+ _{y todos los} estudios posteriores han confirmado el papel principal del Ca2+ _{en su activación. De} hecho, entre todos los factores activadores que hasta el día de hoy han sido encontrados,

Figura 4. Esquema de la estructura obtenida por cristalografía de la m-calpaína en su conforma-

ción libre de Ca2+ _{(izquierda) y unida a Ca}2+ _{(derecha). DI corresponde a los dominios I y IIA del} texto, y DII al IIB; el dominio V no está representado al no ser detectable por cristalografía. Las flechas rojas y punteadas indican los cambios inducidos por la unión del Ca2+_{.(Moldoveanu et al.,} 2008)

el Ca2+ _{es el único que puede activar las calpaínas in vitro por sí solo en ausencia de otros} agentes. No obstante, la concentración de Ca2+ a la que estas proteasas se activan in

vitro, especialmente en el caso de la m-calpaína, es inalcanzable mediante mecanismos

fisiológicos, por lo que se sugiere que otros factores regulan la actividad de las calpaínas, ya sea reduciendo los requisitos de Ca2+ de la proteasa o colocándola en presencia de altas concentraciones locales de Ca2+. Por tanto, la regulación de la actividad de la µ- calpaína y de la m-calpaína en situaciones fisiológicas es un sistema complejo y aún poco definido; de estos factores adicionales se ignora si todos ellos tienen relevancia fisioló- gica así como si participan en varios o todos los procesos celulares en los que se activan las calpaínas, o si los mecanismos de regulación de su actividad difieren entre tipos celu- lares. Incluso en aquellos casos en los que trastornos patológicos provocan una sobrecarga de Ca2+ en el citosol, el resto de factores podrían continuar modulando la actividad de las proteasas y, por tanto, afectar al desarrollo de la enfermedad. Entre estos reguladores que se han descrito están la fosforilación, la interacción con fosfolípidos o su transloca- ción a membrana, activadores proteicos y la calpastatina, su inhibidor endógeno (Goll et al., 2003).

3.3.1. Ca

El Ca2+ _{activa las calpaínas mediante la inducción de cambios conformacionales en} la subunidad de 80 kDa que a su vez provocan la alineación del centro catalítico. A partir de estudios cristalográficos de la estructura de la m-calpaína, este proceso de activación parece tener dos fases: en una primera, el Ca2+ _{se une a los dominios IV y VI (4 iones en} cada dominio), lo que provoca un acercamiento de estos dominios hacia el núcleo catalí- tico (dominio II), un desplazamiento del dominio I, que se disociaría del dominio VI, y una interacción de los dominios IIa y III que estabilizaría el núcleo de la enzima; en una segunda fase, la unión de Ca2+ _{a los lugares de unión en el dominio II alinearía los dos} subdominios de manera que el centro catalítico se formaría (Figura 4) (Moldoveanu et al., 2002; Hanna et al., 2008; Moldoveanu et al., 2008). A partir de estudios de substitución de residuos consecutivos de la m-calpaína con la región equivalente de la µ-calpaína, se ha demostrado que las diferencias en cuanto a los requisitos de calcio están determina- das por la proteína completa, estando implicadas regiones que carecen de lugar de unión a Ca2+_{. Se ha propuesto que la disociación de la subunidad catalítica de la reguladora es} parte del proceso de activación de la proteasa; los resultados experimentales son contra- dictorios y tanto la existencia de esta disociación en condiciones fisiológicas, como su

posible función como parte del proceso de activación, o reduciendo la estabilidad de la proteasa (y, por tanto, inhibiendo su actividad), siguen por determinar (Goll et al., 2003).

3.3.2. Autolisis

La autolisis del extremo aminoterminal de las calpaínas es un fenómeno que tiene lugar en presencia de altas concentraciones de Ca2+ _{y cuyo papel en el proceso de activa-} ción de las proteasas no está claro. La autolisis se da tanto en la subunidad grande (dominio I) como en la pequeña (dominio V) de forma rápida y reduce la concentración de Ca2+ _{necesaria para que la proteasa sea activada (para la µ-calpaína, la concentración de} Ca2+ _{para actividad semimáxima pasa de 3-50 µM a 0.5-2.0 µM, y para la m-calpaína, de} 400-800 µM a 50-150 µM). Y en estudios cinéticos la autolisis precede a la actividad, sugi- riendo que la autolisis es un paso del proceso de activación y que las calpaínas son proen- zimas. No obstante, las concentraciones de Ca2+ _{necesarias para inducir esta proteolisis} son similares a las requeridas para su activación (50-150 µM para la µ-calpaína, 550-800 µM para la m-calpaína), la autolisis reduce la estabilidad de la proteína, se ha observado actividad proteolítica en calpaínas no autolizadas, y la estructura de la m-calpaína descarta que los dominios I o V bloqueen el centro catalítico de la proteasa. Además, los resultados en células o tejidos que muestran actividad proteolítica de las calpaínas no permiten afirmar o negar la existencia de autolisis, por lo que el papel de ésta en la acti- vación de las calpaínas continúa siendo controvertido (Goll et al., 2003).