Estructura de las Hsp

El alto grado de conservación en la familia de las Hsp70 ha producido un modelo de estructura. Todos los miembros de la familia presentan una secuencia amino terminal ATPasa altamente conservado, seguido por una porción carboxi-terminal menos conservada que se cree que contiene un sitio de unión péptida. Algunos miembros de la familia también tienen compartimentos específicos amino terminal con señales de retención carboxi-terminal (Forreiter y Nover, 1998).

La parte principal del plegamiento de las proteínas es ocupado por las Hsp70 (DnaK). Un número de procesos aparentemente dispares en constante incremento se caracteriza por depender de los sistemas de Hsp70. Así, por ejemplo en el proceso de formación de proteínas nuevas en el citoplasma, el retículo endoplasmático y otros organelos, reorganización del sistema del citoesqueleto, importar y exportar proteína nuclear, protección de estructura nuclear, función bajo estrés y degradación de proteína (Nover y Scharf, 1997). La función básica de las Hsp70 en todos los casos es evidentemente la unión y la liberación subsecuente de proteínas parcialmente desplegadas en un ciclo dependiente de ATP (Fig.1).

Fig 1. Modelo de interacción las Hsp70. Las hsp70 interactúan y facilitan la maduración de proteínas sintetizadas de nuevo. Trayectoria monomérica (1), proteínas que son ensambladas dentro de una estructura oligomérica (2), y las proteínas que son traslocadas desde el citosol dentro de organelos. El plegamiento de proteínas ocurre dentro de los organelos (Beckman et al., 1990)

Miembros de la familia Hsp70 consisten de un polipéptido simple con dos campos funcionales. El campo N-terminal es capaz de unir e hidrolizar ATP, mientras que el campo de unión péptida C-terminal contiene cuatro paquetes hidrofóbicos para la unión de proteínas no plegadas (objetivo). Después de la unión de ATP, la Hsp70 es capaz de interactuar con proteínas no nativas, se caracterizan por la exposición de péptidos hidrofóbicos en la superficie. La subsecuente hidrólisis de ATP genera un complejo de Hsp70-ADP unido fuertemente con el sustrato de proteína. Después del

cambio ADP → ATP, el polipéptido objeto es liberado para someterse a un

plegamiento en solución (Fig.1). Varios ciclos de unión, liberación y plegamiento se pueden requerir para obte ner la conformación nativa de un polipéptido objetivo (Forreiter y Nover, 1998).

La Hsp70 necesita interactuar con otras proteínas para desarrollar su actividad de chaperona (Cuadro 2). La más importante es la Hsp40 (DnaJ). La parte N-terminal de esta última contiene el campo 70-aminoacido importante para la interacción con Hsp70, seguido por 30 residuos ricos en glicina y fenil-alanina, una región rica en

cisteína formando un dedo -Zn y el campo de unión péptido C-terminal (Forreiter y Nover, 1998).

Actualmente el campo-J conservado ampliamente no se encuentra solo en las Hsp40, sino también en otras proteínas que interactúan con las Hsp70 (Cyr et al., 1994). Puesto que la Hsp70 tiene una actividad ATPasa débil, se considera que la proteína objetivo es unida por la Hsp40. En ambos casos de interacción, con la co- chaperona resulta en una actividad ATPasa marcadamente incrementada de Hsp70. A cualquier rango la Hsp40 se considera como una subunidad de la Hsp70, complejo esencial para acoplar el ATP hidrolizado a una unión del sustrato (Forreiter y Nover, 1998).

Para un cambio efectivo de ADP, se requiere un factor adicional descrito como proteína GrpE para E. coli en el sistema DnaK/j. Una proteína funcionalmente relacionada para eucariotes, fue identificada como proteína BAG-1 (Zeiner et al., 1997; Hohfeld y Jentsch, 1997). BAG-1 descrita originalmente como componente del Bcl2 que es un sistema que regula el ciclo de la célula y la apoptosis en mamíferos (Takayama et al., 1995). Aunque BAG-1 y GrpE no comparten homología en las secuencias, ambas tienen funciones bioquímicas similares y unen al ATP con las Hsp70 (Forreiter y Nover, 1998).

Otros componentes conectados con Hsp70 son HIP (proteína que interactúa con las Hsp70) y HOP (proteína organizadora Hsp70), también conocida como la p60, componente del complejo de las Hsp90 (Smith et al., 1993; Johnson y Craig, 1997). La HIP une el campo HTPasa de Hsp70, así estabiliza la forma de ADP-unión. Subsecuentemente, HOP interactúa con el campo de unión péptida. El HOP/p60 también tiene un sitio de unión Hsp90, y esto puede unir los sistemas chaperonas Hsp70 y Hsp90 (Forreiter y Nover, 1998).

Las proteínas de 70kDa son polipéptidos simples con campos terminales en los cuales se agrupan, por un lado el ATP y por el otro las proteínas que fueron

lesionadas por el estrés. Para el cabal funcionamiento de las Hsp70 es necesaria la participación de otras familias de proteínas de choque calórico. Este es parte del mecanismo que se lleva a cabo para los organismos que presentaron un estrés calórico, donde además se expresan otras familias de Hsp.

2.3.5 Proteínas de choque calórico Hsp90

La Hsp90 pertenece a las chaperonas citosólicas más abundantes constitutivamente expresadas en células eucarióticas (Hendrick y Hartl, 1993; Nemoto y Sato, 1998).

2.3.5.1 Función de las Hsp90

Las Hsp90 entre otras funciones, ayudan a prevenir el agrupamiento de otras proteínas que están desplegadas debido al incremento de la temperatura, hasta que ellas pueden replegarse dentro de su propia conformación; también se asocia con componentes celulares, incluyendo receptores de hormonas esteroides en la conformación correcta para responder rápidamente a las señales (Pennisi, 1996); así mismo, juegan un papel importante en la regulación de enzimas y transcripción de proteínas dentro de la célula (Georgopoulos y Welch, 1993). Bajo esta consideración, las moléculas Hsp90 sirven como “organizador” que trae moléculas juntas, auxilia en sus ligaduras, y separación de complejos resultantes (Max et al., 1994).

En la familia de las proteínas de choque calórico, se tiene bien caracterizada a las proteínas de 90-kDa (Hsp90) y las de 94-kDa, proteína reguladora de glucosa grp94. La Hsp90 es una proteína citosólica, mientras que la mayoría de las grp94 permanecen el retículo endoplasmático. Las dos proteínas son 50 % idénticas, y su existencia es probablemente el resultado de una duplicación de genes que ocurrió en un tiempo reciente en la evolución de células eucarióticas (Gupta, 1995).

Las funciones del campo N-terminal es la estabilización de proteínas desnaturalizadas, mientras que el campo C-terminal interactúa con substratos

parcialmente estructurados, intermedios en la síntesis de proteína de novo (Forreiter y Nover, 1998).

Las Hsp90 además de poseer la capacidad de conservar proteínas en un estado competente de plegamiento, juegan un papel importante en la transducción. Esto ha sido demostrado en la maduración y activación de las proteínas cinasas Ser/Thr y Tyr, así como para la maduración y ciclo funcional de receptores de hormonas esteroides (Chang et al., 1997). Ambos procesos requieren la interacción con la Hsp70. La interacción entre los sistemas de Hsp70 y Hsp90 es mediada por las proteínas HIP y HOP. Subsecuentemente el complejo Hsp90 interactúa con otras tres proteínas, dos peptidil-prolil isomerasas, FKBP52 y Cyp40 y una proteína pequeña acídica, p23. Dos de ellas la FKBP52 y la p23 se reportan que actúan como chaperonas moleculares por sí mismas (Bose et al., 1996).

Las funciones características de diferentes familias muestran que las chaperonas moleculares 90-kDa son más “pasivas” en la mayoría de los casos, ellas solo previenen la agregación de conformaciones inestables de proteína, la cual es una característica general (Welch y Brown, 1996).

Algunas observaciones in vitro muestran que la actividad chaperona de las Hsp90 está activada a temperaturas altas, correspondiendo al rango usual de choque calórico celular (Yonehara et al., 1996). Asimismo muestra retener parcialmente proteína desnaturalizada en un estado de plegamiento competente, el cual puede ser un mecanismo importante in vivo del rescate de funciones después del estrés celular. Pruebas avanzadas in vivo muestran la importancia de la Hsp90 en el plegamiento de proteína después del estrés, niveles altos de Hsp90 incrementan la resistencia al calor de las células respectivas (Heads et al., 1995).

Fig 2. Las propiedades bioquímicas de las chaperonas moleculares. Estas previenen la agregación y facilitan el replegamiento de las proteínas. La proteína nativa es desnaturalizada. La dilución en una proteína no específica (albumina de suero bovino BSA), conduce al estado agregado que no es resolubilizado por chaperonas (Hsp90, Hsp70, Hdj1) en la presencia de ATP. En contraste, la dilución de estado implegado en Hsp70, Hdj1 y ATP origina el replegamiento al estado nativo enzimático activo. La unión o el estado de plegamiento intermedio es llevado a cabo por la sp90 o Hsp70; la adición subsecuente de Hsp70, ATP, y la co-chaperona Hdj1 conduce el plegamiento del estado nativo (Morimoto y Santoro, 1998)

Información reciente sugiere que la Hsp90 generalmente no protege proteínas de la inactivación térmica, pero incrementa el rango al cual la proteína dañada por el calor es reactivada. Desde esta perspectiva, el 1-2% de la proteína celular total parece comportarse como un “bombero” de la célula, situación que se observa en la mayoría de las veces. Esto explica la gran cantidad de la 90 kDa constitutiva que se requiere y que es específica para eucariotes (Csermely et al., 1998a).

La Hsp90 es una proteína abundante en citosol que evita el agrupamiento de proteína dañada por el estrés calórico y que pueda replegarla y activarla de nuevo.

De acuerdo a esta función, esta proteína se expresa al igual que la Hsp70 en organismos que son sometidos a un tipo de estrés.

2.3.5.2 Estructura de las Hsp90

Así como la proteína procariótica HtpG, la Hsp90 es también un dímero fosforilado, contiene 2 a 3 moléculas de fosfato por monómero unidas covalentemente. La dimerización es necesaria para las funciones vitales de la Hsp90 (Minami et al., 1994). En la presencia de detergentes no iónicos, y después de tratamiento con calor, preferencialmente forma oligómeros. La tendencia es la oligomerización de Hsp90 “nativa”, especialmente en presencia de cationes bivalentes, nucleótidos y concentraciones altas de Hsp90 (Freitag et al., 1997).

Así, como muchas otras proteínas, la Hsp90 es una proteína hidrofóbica y su hidrofobicidad se incrementa, aún más, después del choque calórico. Por otro lado las Hsp90 también contiene dos campos altamente cargados: uno es el campo de unión entre los campos N - terminal y C-terminal (esta estructura se presenta solo en los eucarióticos homólogos Hsp90), y el otro esta en campo C - terminal. Estas estructuras (juntas con las superficies hidrofóbicas expuestas) probablemente también están involucradas en la determinación de las características de unión de proteínas. De acuerdo con esta predicción, estudios indican que las Hsp90 muestran preferencias por proteínas cargadas positivamente o hidrofóbicas (Csermely et al., 1998a).

La Hsp90 es probablemente una de las proteínas “más pegajosas” del citosol, una reina de “goma molecular” en células. Junto con las cinasas y fosfatasas, la Hsp90 une un amplio rango de otras proteínas, incluyendo: varios receptores de hormonas, actin, tubulin, factor de choque calórico-1, calmodulin, calpain, y proteasoma (Csermely et al., 1998a).

La Hsp90 forma un amplio complejo citosólico con numerosas chaperonas moleculares tales como: las Hsc70, las inmunofilinas, la CDC37, y p23 (Pratt, 1993). Estudios recientes demostraron, que la Hsp90 posee un sitio de unión de ATP y una capacidad de autofosforilación. También experimenta un alto cambio conformacional después de la adición de ATP (Csermely et al., 1998).

Las Hsp90 pueden ser inhibidas en su actividad de chaperona por compuestos como la geldamicina y otros relacionados con la ansamicina, que son descritos como anti- tumorales. Al hacer un análisis de la estructura cristal del campo N-terminal de Hsp90 se observa una molécula de ATP y un sitio de unión con la geldanamicina. Evidentemente, la geldanamicina no se une al campo de unión péptido, pero compite con el ATP por el sitio de unión nucleótido que no necesita ATP (Forreiter y Nover, 1998).

Recientemente, complejos de ATP y ADP de campo N- terminal de Hsp90 se cristalizaron, y métodos con la mejor resolución, usando pruebas conformacionales, confirmaron también la unión de ATP a Hsp90, aunque con una afinidad bastante baja. Otros nucleótidos como ADP o CTP tienen una afinidad mayor con la Hsp90 que la ATP (Csermely et al., 1998).

Aunque la estructura primaria de la Hsp90 fue descrita hace muchos años, poco se conoce acerca del papel funcional de varios segmentos de la proteína. Estudios de microscopía electrónica y bioquímicos indican que ésta contiene dos campos claramente distinguibles que están unidos a otros, por un lazo altamente cargado y relativamente flexible. El campo C-terminal, por sí mismo, puede tener una estructura bilobular (Nemoto et al., 1997).

La Hsp90 presenta al igual que la Hsp70 dos campos terminales; el campo amino y el carboxi, los cuales están muy cargados, de manera que esta proteína presenta gran pote ncial para unir proteína desplegada, sobre todo, en el campo terminal carboxil hasta que se repliegue.