Estudio de mutaciones en EGFR: metodologías

Para realizar el estudio de mutaciones en el gen EGFR se emplearon tres metodologías: secuenciación directa del producto de PCR, PCR cuantitativa en tiempo real e IHQ. A continuación se describe en profundidad cada una de las técnicas.

En el caso de los dos métodos basado en PCR fue necesario proceder a la extracción de ADN de cada uno de los tumores incluidos en los análisis. Previamente, se realizaron y tiñeron con H&E secciones representativas de los tumores para su revisión por dos patólogos (EC y FL- R), quiénes realizaron el diagnóstico anatomopatológico, y evaluaron el porcentaje de celularidad

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tumoral así como otras características histológicas, como la presencia de inflamación (considerada relevante si los linfocitos representaban >10% del tumor, valorados en campo 20x) o de mucina extracelular (considerada relevante si suponía >50% del tumor). Con el objetivo de enriquecer el porcentaje de celularidad tumoral así como eliminar áreas de necrosis, inflamación o mucina extracelular, se realizó, en función del material disponible para el estudio mutacional, macrodisección de los tumores siguiendo protocolos previamente descritos (Angulo et al., 2010). La extracción de ADN se realizó según protocolos ya descritos (Angulo et al., 2010), y la metodología empleada en el estudio de dianas terapéuticas y marcadores predictivos, que se ha detallado con anterioridad en el presente trabajo.

3.3.2.1. Estudio de mutaciones en EGFR mediante secuenciación directa del producto de PCR

La presencia de mutaciones en el gen EGFR (exones 18-21) se determinó, en primer lugar, mediante secuenciación directa del producto de PCR siguiendo protocolos previamente descritos (Conde et al., 2006), y según la metodología empleada en el estudio de los perfiles de expresión génica y en el estudio de dianas terapéuticas y marcadores predictivos en NSCLCs, que se ha detallado con anterioridad en el presente trabajo.

3.3.2.2. Estudio de mutaciones en EGFR mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Como segundo método, se utilizó el kit Therascreen EGFR Mutation Test (Qiagen Manchester Ltd., Manchester, UK), que está diseñado para la detección de 29 de las mutaciones más frecuentes en EGFR: 19 deleciones en el exón 19, tres inserciones en el exón 20 y las mutaciones puntuales G719X (exón 18), S768I y T790M (exón 20), y L858R y L861Q (exón 21). El kit combina dos tecnologías: ARMSTM (Astrazeneca) y ScorpionsTM (Qiagen Manchester Ltd.) para la detección de mutaciones mediante PCR cuantitativa en tiempo real (Newton et al., 1989; Whitcombe et al., 1999; Thelwell et al., 2000). La amplificación específica de alelo se consigue mediante la tecnología ARMS, que se basa en el empleo de un primer diseñado específicamente para ser complementario de la secuencia mutada y no de la secuencia wild-type, de tal manera que sólo en presencia de la mutación se producirá la unión entre primer y secuencia diana y tendrá lugar la amplificación del producto de PCR. La tecnología Scorpions, por su parte, permite detectar la amplificación del producto de PCR a través del incremento de la fluorescencia. El kit dispone de ocho ensayos diferentes, uno control para evaluar la calidad y cantidad del ADN analizado, y siete para detectar los diferentes tipos de mutaciones cubiertas por el kit (deleciones, inserciones y cada una de las cuatro mutaciones puntuales).

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La amplificación se realizó siguiendo las indicaciones del fabricante en la plataforma ABI Prism 7300 (Applied Biosystems). El análisis de los resultados se basó en el cálculo de la diferencia de Cts, ∆Ct, (del inglés, cycle threshold) entre el ensayo de la mutación correspondiente y el ensayo control, quedando definido el Ct como el ciclo de PCR a partir del cual se produce un incremento significativo de la señal de fluorescencia por encima del ruido de fondo. De esta manera, una muestra se clasificaría como mutada o wild-type para una de las mutaciones cubiertas por el kit en función de si dicho valor ∆Ct queda por debajo o por encima del punto de corte establecido en los parámetros analíticos del kit.

3.3.2.3. Estudio de mutaciones en EGFR mediante inmunohistoquímica

La presencia de mutaciones en los exones 19 y 21 del EGFR también se estudió mediante IHQ, empleando para ello dos anticuerpos que reconocen específicamente algunas de las formas mutadas del receptor EGFR (Yu et al., 2009). Uno de los anticuerpos está dirigido frente a la deleción de 15 nucleótidos E746-A750 en el exón 19 (clon 6B6, dilución 1:25; Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA) y el otro detecta específicamente la mutación puntual L858R en el exón 21 (clon 43B2, dilución 1:100; Cell Signaling Technology Inc.). La técnica se realizó sobre secciones completas de 4µm, de forma automatizada en la plataforma Benchmark XT (Ventana Medical System Inc.), según las indicaciones del fabricante. Los protocolos de desenmascaramiento utilizados fueron CC1 estándar durante 60 minutos, y CC1 suave durante 30 minutos, respectivamente. Las condiciones de incubación fueron 32 minutos a temperatura ambiente, para el anticuerpo dirigido contra la deleción del exón 19, y 92 minutos a 37ºC, para el anticuerpo dirigido contra la mutación puntual en el exón 21. La detección antigénica en ambos casos se realizó con Ultraview Universal DAB Detection Kit. Finalmente todas las preparaciones fueron contrateñidas con Hematoxilin II seguido de Bluing Reagent, durante 4 minutos, en ambos casos.

La valoración de todas las preparaciones fue realizada por dos patólogos (EC y FL-R), de forma independiente y sin tener en consideración el estatus mutacional de EGFR establecido por cualquiera de los métodos anteriores. En base a puntos de corte ya establecidos (Brevet at al., 2010; Kawahara et al., 2010), se establecieron los siguientes criterios de valoración. En el análisis de la expresión de ambos anticuerpos se consideraron tanto la intensidad de la tinción citoplasmática y/o membranosa, como el porcentaje de células tumorales inmunorreactivas. Para la valoración de la intensidad se establecieron cuatro categorías: 0, en ausencia de positividad para el anticuerpo o si la tinción era débil y estaba presente en <10% de las células tumorales; 1+, si la tinción era débil y estaba presente en >10% de las células tumorales; 2+, si las células tumorales presentaban una tinción moderada; y 3+, si las células tumorales presentaban una

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tinción intensa. De esta manera, las categorías 0 y 1+ se clasificaron como negativas y las categorías 2+ y 3+ se clasificaron como positivas.