Como hemos comentado anteriormente, hemos realizado un modelo animal de EAD para poder controlar las diferencias entre los grupos experimentales debidas a factores externos. Por otro lado, se pretendía implementar el modelo animal en el laboratorio para futuros estudios funcionales in vivo que se puedan derivar de los estudios –ómicos realizados en esta Tesis Doctoral. Decidimos utilizar un modelo conjunto de aterosclerosis y EAD basado en una alimentación rica en colesterol y suplementada con vitamina D2 (61). El aumento del gradiente transvalvular, valorado mediante ecocardiografía, confirmó el desarrollo de EAD en los conejos. Además, los análisis bioquímicos mostraron un incremento significativo en los niveles de calcio, fósforo, colesterol (total, LDL y no-HDL) y triglicéridos, características observadas en los pacientes con EAD (175, 176).
Tras el análisis proteómico, 8 proteínas diferenciales fueron identificadas. La albúmina sérica, la cadena α-1 de la tropomiosina, la cadena B de la L-lactato deshidrogenasa, la cadena ligera de la miosina 3 y la cadena ligera reguladora de la miosina 2 (isoforma de músculo cardiaco/ventricular) estaban aumentadas en controles mientras que la calreticulina, la tranglutaminasa 2 y la ATPasa del retículo endoplasmático transicional (también llamada VCP, valosin-containing protein) estaban aumentadas en el grupo patológico.
Las miosinas (formadas por cadenas como la cadena ligera de la miosina 3 y la
cadena ligera reguladora de la miosina 2) y la cadena α-1 de la tropomiosina
forman parte, junto con la actina, del músculo cardíaco, por lo que en el ámbito de la cardiología han sido estudiadas principalmente a nivel de miocardio y es la primera vez en la que se demuestra su expresión en la VA humana y su implicación en la EAD. Están implicadas en la contracción del ventrículo, y se han relacionado en estudios
129
previos con la hipertrofia ventricular (177, 178). Estas proteínas también forman parte del citoesqueleto contráctil de otras células, como fibroblastos y endoteliales, y son imprescindibles en el mantenimiento de la función de la barrera endotelial (179). Por un lado, se ha visto que la sobre-expresión de TPM-1 estabiliza la estructura de los filamentos de actina, ayudando a preservar la función de la barrera endotelial bajo condiciones de estrés oxidativo (180). Además, su disminución se ha relacionado con una menor contracción de los filamentos de actina en arterias con arteriosclerosis (181). Por otro lado, la disminución de los niveles de proteínas de citoesqueleto en arterias coronarias ateroscleróticas se ha relacionado con una pérdida del fenotipo contráctil de las VSMC (182). La disminución encontrada en proteínas de citoesqueleto puede estar relacionada con la pérdida de flexibilidad de la válvula aórtica así como, de forma paralela a lo descrito en aterosclerosis, ser un indicativo de la diferenciación de las células intersticiales de la válvula a osteoblastos, que no tienen capacidad contráctil (183, 184). Además, la ausencia de miosina también provoca alteraciones en la adhesión celular y la organización tisular debido a defectos en la localización y formación de los complejos proteicos necesarios para las uniones célula-célula (185), lo que puede provocar un aumento de la permeabilidad del endotelio. La disminución observada en estas miosinas y en la tropomiosina-1 en los conejos del grupo patológico parece ser un reflejo de la diferenciación celular previa a la calcificación. Además, también podría ser indicativo de una alteración en la regulación del citoesqueleto de las células endoteliales, lo que podría implicar una disfunción endotelial.
Por otro lado, se ha relacionado la diferenciación de VSMCs a células osteogénicas (186), así como la infiltración de monocitos en aterosclerosis (187), con la proteína
transglutaminasa 2, aumentada en el grupo patológico. Esta proteína desempeña un
papel importante en la apoptosis, diferenciación celular y la estabilización de la matriz extracelular (188). El aumento de tranglutaminasa 2 en la EAD puede estar implicado en los mismos procesos que en la aterosclerosis, ya que son muy similares en ambas patologías.
En el caso de la válvula estenótica, se produce una disminución de aporte de oxígeno a las células debido a un aumento en el grosor del tejido. En estas condiciones, se produce una situación de hipoxia que favorece la síntesis de lactato desde el piruvato mediante la cadena A de la L-lactato deshidrogenasa, una de las isoformas más importante de la
130
enzima lactato deshidrogensa (189). En el corazón, sin embargo, existe una isoforma denominada cadena B de la L-lactato deshidrogenasa, que lleva a cabo esa misma reacción en condiciones aerobias (189) y que se regula a la baja en condiciones de escasez de oxígeno (190, 191), como muestran nuestros resultados.
Recientemente, se ha relacionado la calcificación valvular con aumento del estrés del retículo endoplasmático (ERS, endoplasmic reticulum stress) (192). Los autores de este estudio demostraron que el oxLDL promueve la diferenciación osteoblástica y la inflamación a través de la activación de la vía de ERS. En nuestro trabajo, hemos encontrado niveles aumentados de calreticulina y ATPasa VCP en los animales del grupo patológico, ambas relacionadas con la acumulación en el retículo de proteínas plegadas incorrectamente, lo que provoca alteraciones en las funciones del orgánulo y, por tanto, ERS. La calreticulina es una chaperona implicada en el plegamiento de glicoproteínas y en el mantenimiento de unos niveles de calcio adecuados para el organismo, inducida en condiciones de estrés del RE (193, 194). Esta chaperona actúa como control de calidad, seleccionando las proteínas mal plegadas para su degradación (195). Las proteínas seleccionadas son transportadas al citosol a través de la ATPasa VCP y degradadas por el sistema ubiquitina-proteosoma (196). El aumento de calreticulina y ATPasa VCP encontrado en los animales del grupo patológico apoya la implicación de la vía de ERS en el desarrollo de la EAD y parece apuntar de nuevo al fenómeno de diferenciación de VICs a osteoblastos, que ha sido relacionado directamente con la activación de esta vía (192).
También hemos encontrado una disminución de albúmina, seguramente debida a la inflamación ya que se trata de una proteína de fase aguda negativa (197). Sin embargo, las proteínas de fase aguda no son específicas y se encuentran alteradas en numerosas patologías (197, 198).
En resumen, podemos decir que el modelo animal de EAD nos ha permitido identificar 8 proteínas diferencialmente expresadas entre el grupo patológico y el sano. Hay que destacar que 3 podrían estar implicadas en la diferenciación celular de las VICs a un fenotipo osteogénico y en el mantenimiento de la integridad celular. También se ha observado la importancia de una correcta síntesis proteica y la implicación del estrés del retículo endoplasmático en la enfermedad. Este hecho refuerza además el papel de la
131
diferenciación osteoblástica en el desarrollo de la EAD, debido a que se ha descrito una implicación directa de ésta con la vía de ERS.
2. ESTUDIO DE PROTEÓMICA Y METABOLÓMICA DE LA ESTENOSIS