Tal y como se ha comentado en la Introducción General, la despolimerización de los microtúbulos ocasionada por la acción de los VDAs, da lugar en las células endoteliales a la activación de una cascada intracelular de quinasas que conducen a la contracción de las fibras de actina, y en definitiva, a cambios morfológicos cruciales para la adecuada función del endotelio.39
De esta forma, una vez comprobada la unión específica de estas chalconas a tubulina, así como la capacidad de las mismas para interrumpir una red de tubos endoteliales, se decidió estudiar el efecto
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A
Figura 2.13. Efecto interruptor de estas chalconas sobre una red vascular de células endoteliales. Las células HMEC-1 se cultivaron sobre matrigel, donde crecen formando tubos. Tras 3 h se añadió DMSO (0.1%), CA-4P (i.6) (0.01, 0.03 y 0.3 M) o 2.16a (0.1, 0.3, y 3 M).Fotografías tomadas tras 90 min de tratamiento con los compuestos i.6 y 2.16a.
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de estos compuestos sobre la morfología de células endoteliales (HMEC-1). Para ello, las células se incubaron durante 8 horas bien con DMSO (0.1%) o bien con la chalcona 2.16a (1 M), y a continuación se preparó una tinción celular para visualizar las fibras de actina por microscopía confocal. Al mismo tiempo se tiñeron tanto el ADN como los microtúbulos, con el fin de estudiar también el efecto sobre las fibras del huso mitótico antes explicado. Como se observa en la Figura 2.14, las células no tratadas (DMSO), mantuvieron la morfología típicamente alargada y plana de las células endoteliales. Ahora bien, el tratamiento con el compuesto 2.16a condujo a células visiblemente redondeadas y contráctiles, poniendo así de manifiesto el cambio morfológico radical que estas chalconas ocasionaban sobre las células endoteliales. Esto podría dar lugar al debilitamiento de las uniones intercelulares y al incremento en la permeabilidad endotelial, y de esta forma desencadenar el colapso vascular característico de los VDAs. Asimismo, en la Figura 2.14 se presenta nuevamente el efecto interruptor del huso mitótico que la chalcona 2.16a provocó sobre aquellas células endoteliales que se encontraban en división (panel de tubulina).
Figura 2.14. Efectos de estas chalconas sobre el citoesqueleto de actina y la morfología de las células endoteliales. Las células HMEC-1 se trataron con 1 M de 2.16a durante 8 h y luego fueron fijadas y teñidas con el anticuerpo anti-tubulina (verde), DAPI (azul) que se fija al ADN, y tetrametilrodamina B faloidina-isocianato (rojo) que se une a las fibras de actina. Para el experimento control se emplearon células tratadas con DMSO (0.1%). Imágenes tomadas por microscopía confocal.
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2.2.4. DETERMINACIÓN DE LA SOLUBILIDAD DE 2.20
Una vez demostrada que la actividad antiproliferativa de estas chalconas podía atribuirse a su capacidad de interaccionar con tubulina en el sitio de colchicina, así como su actividad antimitótica y antivascular, nos centramos en el compuesto más potente (la metilchalcona 2.20) para determinar su solubilidad y estimar así su potencial biodisponibilidad. Para este estudio de solubilidad se suspendió un exceso del compuesto 2.20 en tampón fosfato (PBS) y la muestra se agitó durante 2 horas. Posteriormente, esta muestra se filtró y la cantidad disuelta se cuantificó por HPLC, interpolando los resultados obtenidos en rectas patrón (previamente elaboradas a partir de concentraciones conocidas de 2.20). El valor de solubilidad de 2.20 fue de 0.016 mg/ml (46 M), dato que comprometía el planteamiento de los estudios de eficacia y toxicidad in vivo. Con el objetivo de incrementar la solubilidad de este compuesto tan prometedor, se planteó la preparación de profármacos de 2.20 mediante derivación del grupo amino del anillo B.
2.2.5. SÍNTESIS Y EVALUACIÓN DE PROFÁRMACOS DE 2.20
Una de las estrategias más habituales para mejorar la solubilidad acuosa de compuestos activos altamente hidrófobos es a través de la preparación de profármacos. Un profármaco se define como una forma inactiva de la sustancia de interés que experimenta la conversión al compuesto activo dentro del organismo por un proceso químico o metabólico (Figura 2.15A).40 Normalmente, un
profármaco consiste en un fármaco unido covalentemente a un grupo transportador, si bien la unión debe ser lo suficientemente lábil como para permitir que el fármaco se libere con facilidad en el organismo. Es importante resaltar que el transportador debe ser inerte biológicamente (no debe presentar ninguna actividad biológica ni ser tóxico), así como fácilmente metabolizable y excretable. En este sentido, los profármacos de aminoácidos han sido ampliamente utilizados para incrementar la solubilidad de fármacos con grupos hidroxilos o aminos libres, mediante la formación de un enlace éster o amida, respectivamente (Figura 2.15B).40,41
A
B
Figura 2.15. (A) Representación simplificada del concepto profármaco. (B) Derivación de un fármaco con un grupo hidroxilo o amino primario a un profármaco de éster o amida, respectivamente, a partir de un transportador con un grupo ácido carboxíico libre. F: fármaco; T: transportador.
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Un ejemplo del empleo de aminoácidos como transportadores en profármacos lo constituye el compuesto i.7 (AVE-8062 u ombrabulina) (Figura 2.16), un derivado de L-serina de la combrestatina A-4. Este profármaco con propiedades VDAs42 fue introducido en investigación clínica por Sanofi-
Aventis, y en la actualidad se encuentra en fases II y III. Por tanto, nuestra primera aproximación para la preparación de profármacos de la chalcona 2.20 consistió en la preparación del correspondiente derivado de L-serina sobre el grupo amino del anillo B.
Como segunda aproximación para la preparación de profármacos de 2.20 se consideró utilizar el dipéptido L-lisina-L-prolina como grupo transportador. Estudios recientes de nuestro grupo de investigación en síntesis de profármacos sobre grupos OH y NH2 de distintos fármacos, han puesto
de manifiesto que el empleo de oligopéptidos mejora muy notablemente la solubilidad en agua respecto al empleo de un solo aminoácido.43-46Además, estos oligopéptidos son reconocidos por la
enzima endógena dipeptidil-peptidasa tipo IV (DPP-IV/CD26), presente en suero y en distintos tejidos, favoreciéndose de este modo la liberación del fármaco en su forma activa. La enzima CD26 se caracteriza por una gran especificidad de sustrato, dado que principalmente reconoce e hidroliza secuencias dipeptídicas que contienen una prolina en la penúltima posición del extremo N- terminal.47-49 Así, empleando el dipétido L-lisina-L-prolina se podría incrementar la solubilidad
acuosa gracias a la basicidad de la lisina terminal (con dos aminas primarias protonadas a pH fisiológico), mientras que la prolina directamente unida a 2.20 permitiría el reconocimiento por CD26, y por tanto, la liberación del compuesto activo.
Figura 2.16. Estructura de AVE-8062 (i.7)
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