La señal primaria para la activación de los linfocitos T es el aumento bifásico de la concentración intracelular de Ca2+, inducido por la molécula IP3 tras el reconocimiento de un estímulo mitogénico. Por un lado, se vacían los reservorios de Ca2+ del retículo endoplasmático a través de los receptores para IP3 y por otro lado, se produce un influjo de Ca2+ en la membrana plasmática (canales CRAC) sostenido y activado por el vaciado de los reservorios intracelulares de Ca2+ a través de la proteína estromal STIM1. La rapidez y el mantenimiento de influjo de Ca2+ es crucial para la activación de la señalización celular responsable de la activación celular (Oh-hora 2009; Vig and Kinet 2009). Durante la activación celular también se producen cambios en el potencial de membrana plasmática y en el pH intracelular.
Los canales CRAC son independientes del potencial de membrana pero hay otros transportadores de iones Ca2+ que son dependientes de voltaje. Estos canales de calcio dependientes de voltaje, son bloqueados por la disminución del potencial de membrana que se produce como consecuencia del influjo de Ca2+ llevado a cabo por los canales CRAC. Además, los intercambiadores de iones Cl- y K+ ayudan a mantener el potencial de membrana negativo favoreciendo el bloqueo de estos canales de Ca2+ activados por voltaje (Kerschbaum et al. 1997). Este hecho hace pensar que los canales de Cl- y K+ podrían tener un efecto directo sobre los canales de Ca2+ CRAC. Es lógico pensar que se pueda producir una interacción entre los sistemas de transporte de iones Cl- y Ca2+ en la activación y proliferación celular. De hecho ya está descrito que los canales de iones cloruro podrían estar implicados en la
proliferación de diversos tipos celulares (Rouzaire-Dubois et al. 2000; Xiao et al. 2002); incluso está descrito que participarían en la inhibición de la proliferación celular T (Phipps et al. 1996) y que este efecto estaría mediado por la interacción de los canales de Cl- sobre la activación de los canales CRAC y en consecuencia en la activación celular T (Wang et al. 2006).
Por lo que al pH intracelular se refiere, cuando un linfocito murino se activa tras un estímulo mitogénico, tienen lugar dos estados de alcalinización secuenciales. El primero corresponde a la respuesta primaria de activación celular en respuesta al estímulo mitogénico mientras que el segundo estado de alcalinización tiene lugar durante el proceso de proliferación celular (Gerson et al. 1982). Hay datos descritos en la literatura que indican que el grado de alcalinización influye en la magnitud e intensidad del aumento de la concentración de Ca2+ intracelular y por lo tanto, en el grado de activación celular de los linfocitos T (Rosoff and Terres 1986).
En los años 90 se describió que el intercambiador aniónico AE2 está implicado en la regulación del pH intracelular, en el control del volumen celular e incluso en el control de la excitabilidad de la célula, pudiendo, por tanto, jugar un papel importante en los procesos de activación celular y del sistema inmunitario. En el año 93 se observó que la expresión de AE2 estaba disminuida en las biopsias hepáticas de pacientes con cirrosis biliar primaria (CBP), una enfermedad caracterizada por fenómenos de autoinmunidad (Prieto et al. 1993; Medina et al. 1997). Y más recientemente se ha descrito que los ratones knockout para el gen AE2 presentan un fenotipo anormal del sistema inmunitario caracterizado por un descenso en el número de células T reguladoras CD4+CD25+, un aumento en la producción de citocinas pro- inflamatorias, expansión de los linfocitos T CD8+, producción de autoanticuerpos y un descenso en el pH intracelular de los linfocitos (Salas et al. 2008). Estos datos suguieren que los intercambiadores aniónicos podrían estar implicados en la homeostasis de las células T reguladoras. Por ello, nos planteamos el bloqueo de estos intercambiadores para su utilización como inhibidores de la acción de las células T reguladoras y por lo tanto como
potenciadores de la respuesta inmunitaria en enfermedades como el cáncer o infecciones crónicas, donde las células T reguladoras juegan un papel inmunosupresor.
En estos ensayos hemos demostrado que los bloqueantes de los intercambiadores de iones Cl-, lejos de inhibir la proliferación celular de los linfocitos T efectores, pueden revertir ligeramente la función supresora de las células Treg CD4+CD25+. Tanto el DIDS como el NPPB y el NFA pueden restaurar la activación y proliferación de las células T efectoras en presencia de células T reguladoras, así como la expresión de interleucina IL-2. Por lo tanto, podemos pensar que los intercambiadores de Cl- podrían estar implicados en la activación celular linfocitaria.
También hemos demostrado que los linfocitos T efectores y las células T reguladoras presentan una diferente susceptibilidad a la convanavalina A, presentando un mayor influjo en la entrada de Ca2+ en las células T efectoras CD4+CD25- que las T reguladoras. Todo esto sugiere que hay diferencias en las vías de señalización mediadas por Ca2+ de ambos tipos celulares y que cualquier bloqueo en estos canales podría tener un efecto más pronunciado sobre las células T reguladoras. Hay que mencionar que el inhibidor DIDS afecta al flujo de entrada de Ca2+ en los linfocitos T efectores activados con anti- CD3, mientras que en las reguladoras no vemos diferencias significativas con el DIDS. Este dato también corrobora las diferencias en la regulación de la entrada de Ca2+ celular y posterior activación celular de ambos tipos celulares.
Nuestros datos indican que los canales de Cl- parecen estar implicados en la activación celular y teniendo en cuenta el fenotipo de los ratones knockout para AE2, hemos diseñado y sintetizado unos péptidos dirigidos al intercambiador de aniones cloruro AE2 con el fin de bloquearlo y conseguir una reversión de la supresión mediada por los linfocitos T reguladores. Hemos demostrado que algunos interaccionan con AE2 y que tienen una acción mitogénica en presencia del estímulo anti-CD3.
Nuestros datos indican que la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg puede ser regulada o bloqueada, de forma transitoria o temporal, mediante el uso de inhibidores del intercambio aniónico celular, así como por un péptido sintético capaz de unirse al intercambiador AE2. Hemos demostrado que el péptido p17AE2, tiene un efecto potenciador sobre la proliferación de las esplenocitos ante el estímulo de anti-CD3 + IL-2, al mismo tiempo que inhibe la proliferación de los linfocitos T reguladores ante el estímulo de anti-CD3 + IL-2. Por lo tanto, la función supresora de las células Treg se ve afectada por la presencia del péptido p17AE2. Esta inhibición de la función Treg tiene lugar incluso en presencia de una concentración de tapsigargina, que potencia el efecto inmunosupresor de las células Treg.
El efecto p17AE2 sobre la actividad Treg podría estar asociado a su capacidad de inducir la apoptosis en este tipo celular. Por este motivo, decidimos cuantificar el porcentaje de células apoptóticas tras la estimulación de células T efectoras o células T reguladoras con anti-CD3 e IL-2. La presencia de p17AE2 en los cultivos de células T efectoras no tiene un efecto significativo sobre la apoptosis celular. Sin embargo, cuando el p17AE2 se cultiva con los linfocitos T reguladores durante 16 horas, un 43% de ellos entran en apoptosis celular. Estos resultados justifican el efecto observado sobre la proliferación de las Treg, que era significativamente inhibida por el péptido p17AE2. Por lo tanto, el péptido p17AE2 in vitro, es capaz de potenciar la proliferación de las células T efectoras ante un estímulo, al mismo tiempo que induce la apoptosis de las células T reguladoras ante el mismo estímulo.
Hemos realizado estudios preliminares in vivo con el péptido p17AE2. Aunque los resultados sugieren que el p17AE2 reduce el número de células Treg tras su administración por vía intraperitoneal, estos resultados no son concluyentes y no se han incluído en esta tesis. Estos trabajos requieren de nuevos ensayos de optimización de dosis, rutas y pautas de administración para elaborar una conclusión firme. La vida media de los péptidos in vivo es por lo general extremadamente corta. El diseño de péptidos miméticos más resistentes a la acción de las proteasas sería de gran utilidad en este proyecto.