Estudio 2 Evaluación de la capacidad de copigmentación de los extractos

fenólicos de tomillo en jugo de fresa. 2.2.3.1 Obtención del jugo de fresa

El jugo de fresa (Fragaria anannassa) se obtuvo a partir de fresas congeladas La Huerta (Aguascalientes, AGS., México), adquiridas en un supermercado local. Las fresas fueron descongeladas e inmediatamente sometidas a homogenización en una licuadora marca Hamilton Beach 7Blend Master (Washington, NC., E.U.A.) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó gran parte de la materia sólida con centrifugaciones sucesivas en una centrífuga refrigerada marca IEC modelo Centra MP4R (Needham Heights, MA, U.S.A.), primero durante 5 minutos a 4500 rpm y 4ºC, para eliminar semillas y material grueso, posteriormente durante 45 minutos a la misma velocidad y temperatura.

2.2.3.1a Clarificación enzimática

Posterior a la centrifugación, el jugo de fresa crudo obtenido se sometió a clarificación con enzimas pectinasas para eliminar la turbidez debida a la pectina en suspensión. El protocolo NZFCH13 de Novozymes® (2003) para la depectinización de jugo de manzana, fue empleado como guía para establecer las condiciones experimentales. Se agregaron 10µL de extracto enzimático por mL de jugo de fresa, y se colocó en un baño de agua con temperatura controlada a 45ºC durante 15 minutos. Los flóculos resultantes se precipitaron con ayuda de una centrífuga IEC modelo HN-SII (Needham Heights, MA, U.S.A.), a 3500 rpm por 5 minutos y se eliminaron por decantación. Se empleó la prueba del alcohol para corroborar la eliminación de la pectina soluble tomando jugo clarificado (1 mL) y se agregó en tubos de ensayo con 2 mL de isopropanol, se agitó por inversión y se dejo reposar por 4 minutos. La ausencia de precipitado en el tubo de ensayo indica la eliminación de la pectina. Inmediatamente después de la clarificación, el jugo se almacenó a –86ºC hasta su posterior uso para los sistemas de copigmentación.

2.2.3.1b Determinación de antocianinas monoméricas totales por el método de pH diferencial

El método de pH diferencial fue reportado por Wrolstad (1976) para la determinación del contenido de antocianinas monoméricas basado en la transformación estructural reversible que sufren las antocianinas con un cambio en el pH del medio. Siguiendo el protocolo del método, se realizaron diluciones de la muestra con dos soluciones reguladoras, una de acetato de sodio (0.4 M) de pH 4.5 y la otra de cloruro de potasio (0.025 M) de pH 1.0, con un factor de dilución que permitiera absorbancias en un rango de 0.4 a 0.8. Se dejaron equilibrar durante 15 minutos a temperatura ambiente, se realizaron barridos espectrales para determinar la longitud de onda de máxima absorbancia (λmax) en un espectrofotómetro marca Beckman modelo DU

650 (Fullerton, CA., E.U.A.), además se realizaron mediciones a 700 nm para corregir la absorbancia por la turbidez para ambos valores pH. El contenido de antocianinas se calculó utilizando el coeficiente de extinción molar y el peso molecular de la pelargonidina-3-glucósido, antocianina presente en mayor proporción en el jugo de fresa (Anexo 1, Ec. 3 y 4).

2.2.3.1c Determinación de antocianinas por cromatografía de líquidos de alta resolución con detector de arreglo de diodos

La caracterización y cuantificación de las antocianinas presentes en el jugo de fresa

(Fragaria anannassa L.) usado para este estudio, se realizó empleando el método descrito en

el Estudio 3 (Sección 2.2.4.1) pero a 520 nm. Como preparación de la muestra previo a la inyección en el HPLC, se concentraron las antocianinas a partir de 6 mL de jugo de fresa clarificado pasándolo a través una columna de C18, posteriormente se eluyeron las antocianinas con 2 mL de metanol grado HPLC con 0.01% v/v HCl 12 M. Esta solución se pasó a través de acrodiscos de PTFE de 0.45 µm marca Gelman (Ann Arbor, MI., E.U.A.).

2.2.3.2 Sistemas de copigmentación

De acuerdo a estudios previos (Del Follo, 2003 y Covarrubias, 2001) se decidió formular relaciones molares de copigmento:pigmento en niveles de 0, 25, 50, 75 y 100. Estas relaciones estuvieron basadas en la concentración de antocianinas monoméricas totales en el jugo de fresa determinado por el método de pH diferencial y expresados como pelargonidina-3- glucósido, así como en el contenido de fenólicos totales del extracto de tomillo, determinados por el método de Folin-Ciocalteau, y expresados como equivalentes de ácido gálico, como se describió previamente. Los sistemas de copigmentación fueron formulados con 3 mL de jugo de fresa clarificado y un volumen de copigmento tal que proporcionara la relación molar antes

indicada de acuerdo con su concentración de fenólicos totales, y se completaron a un volumen total de 10 mL con buffer de citratos (0.02 M) de pH 3.5 (Anexo 2).

2.2.3.3 Caracterización de la copigmentación 2.2.3.3a Propiedades espectrales

Las características espectrales de los sistemas de jugos de fresa copigmentados con extractos de tomillo, se determinaron mediante barridos espectrales de las muestras en un espectrofotómetro marca Beckman modelo DU 650 (Fullerton, CA., E.U.A.), determinando los cambios hipercrómicos y batocrómicos que tienen lugar en el jugo, en un rango de 420 a 700 nm de acuerdo con el método descrito por Baranac y otros (1996). Dichos cambio se expresan como % de incremento en absorbancia máxima y numero de nanómetros que se desplaza la longitud de onda de máxima absorbancia (λmax) para cada muestra en relación con el jugo sin

copigmento. (Anexo 1, Ec. 1 y 2)

2.2.3.3b Método de pH diferencial

El método empleado para la determinación del contenido de antocianinas monoméricas en los sistemas copigmentados fue el de pH diferencial, reportado por Wrolstad (1976) descrito en la sección 2.3.1b.

2.2.3.3c Color instrumental

Las determinaciones de los cambios visuales en los jugos copigmentados se midieron a través de los parámetros de color instrumental: luminosidad (L*), saturación de color (C*) y ángulo de color (h*). Éstos parámetros fueron obtenidos utilizando un colorímetro Minolta Chroma Meter CR-300 Series (Minolta Co. Ltd., Osaka, Japón) en la escala CIEL*C*h con una fuente de iluminación D65 y un observador estándar de 10°, utilizando un plato de calibración

blanco como fondo reflejante para las celdas.

2.2.3.3d Índice de degradación, color polimérico y porcentaje de color polimérico

Los parámetros empleados para medir la degradación de las antocianinas en el jugo de fresa fueron los reportados por Wrolstad (1976) basado en la asociación que sufren las antocianinas monoméricas con el bisulfito conduciendo a productos incoloros, dejando a las antocianinas poliméricas intactas. Siguiendo el protocolo reportado, se determinó el factor de dilución que proporcionara absorbancias menores a la unidad, así como la longitud de onda de máxima absorbancia (λmax). De acuerdo con este factor, se realizaron diluciones del jugo de

agregó 0.2 mL de una solución de metabisulfito de sodio 20 % p/v a una de ellas, y 0.2 mL de agua bidestilada a la otra. Las soluciones se estabilizaron por 15 minutos a temperatura ambiente y se determinó su absorbancia a 420 nm, λmax, y 700 nm en un espectrofotómetro

marca Beckman modelo DU 650 (Fullerton, CA., E.U.A.). Las relaciones empleadas para el cálculo la densidad de color, color polimérico y % de color polimérico se detallan en el Anexo 1 (Ec. 5, 6 y 7).

2.2.3.4 Copigmentación con sales metálicas

Adicionalmente a los estudios de copigmentación con extractos fenólicos de tomillo, se realizaron pruebas de copigmentación empleando soluciones de alumbre como copigmento. Se empleó alumbre grado alimenticio (KAl(SO4)2.12H2O; McCormick, Valley, MD, E.U.A.) y los

sistemas de copigmentación se evaluaron en rangos de concentración de 0, 50, 100, 200, 400 y 600 ppm de iones aluminio. Los sistemas de copigmentación fueron formulados con 3 mL de jugo de fresa clarificado y un volumen de solución madre de copigmento (10000 ppm) tal que proporcionara la concentración de iones aluminio antes indicada, y se completaron a un volumen total de 10 mL con solución reguladora de citratos (0.02 M) de pH 3.5 (Anexo 2).