Estudio 1 Obtención del extracto acuoso de tomillo y modificación al proceso

2.2.2.1 Obtención del extracto acuoso de Tomillo

Para la obtención del extracto acuoso de tomillo se siguió el procedimiento descrito por la patente No. 5,908,650 de Lenoble (1999). Las hojas secas de tomillo (1 kg) se colocaron en 17 L de agua bidestilada, y se mantuvieron en ebullición a una temperatura de 95ºC durante un periodo de 8 horas, bajo agitación continua y manteniendo el volumen de agua constante. Posteriormente se dejó enfriar a temperatura ambiente y se separaron los sólidos por filtración con tela Miracloth (EMD Biosciences Inc., Darmstadt, Alemania). Se ajustó el pH del extracto a 2 con HCl 12 M. Dicho extracto se centrifugó a 6300 rpm por 24 minutos a 4ºC en una centrífuga Beckman modelo AVANTI J-25 I (Fullerton, CA., E.U.A.). El líquido decantado se filtró con vacío a través de membranas Millipore de 5µm (Bedford, MA., E.U.A.). La solución filtrada se pasó por columnas de C-18 Sep-Pak (Waters Co., Milford, MA., EUA.) con capacidad de 20 mL y 5 g de adsorbente, para retener los compuestos fenólicos del extracto. Dichas columnas fueron activadas previamente con dos volúmenes (40 mL) de metanol grado HPLC con 0.01% v/v HCl 12 M y posteriormente con dos volúmenes de agua grado HPLC con 0.01% v/v HCl 12 M. Los compuestos adsorbidos en la columna C-18 fueron lavados con dos volúmenes (40 mL) de agua ácida, en la concentración antes mencionada. Se pasó aire aproximadamente por un minuto a través de la columna para secar el agua y por último los

compuestos fenólicos se eluyeron de la resina C-18 con 10 mL de metanol acidificado grado HPLC. Los extractos metanólicos resultantes se sometieron a evaporación a presión reducida en un rotavapor Büchi (Flawil, St. Gallen Canton, Suiza) a 45°C y –25 in Hg para eliminar el solvente orgánico. Al final se agregó un 10 % de metanol para facilitar la disolución del extracto en el agua residual. El producto acuoso final se almacenó a –86ºC para su posterior utilización.

2.2.2.2 Modificación del proceso de extracción comercial

Para el fraccionamiento del extracto de tomillo se emplearon dos tipos de intercambiadores aniónicos marca Supelco, una resina débil Diaion® WA30 (identificada en lo sucesivo como WA30) con grupo funcional alquilamina tipo RxNH3OH, donde Rx es la matriz

polimérica de la resina y otra resina Diaion® PA308 (identificada en lo sucesivo como PA308) con grupo funcional benciltrimetilamina tipo RxNR3OH. Ambas fueron previamente hidratadas

con agua bidestilada por 15 minutos, y activadas con solución reguladora de fosfatos pH 6.5, I=0.05 con agitación constante durante 30 minutos. Se cargaron dichas resinas en columnas de polipropileno de 1.5 mL con 1.3 g de resina hidratada y activada. Se realizó una dilución de 5 g del extracto de tomillo en 50 mL de buffer de fosfatos pH 6.5, I=0.05 y se pasaron 6 mL a través de cada columna por acción de la gravedad en un flujo promedio de 4 mL/min, el efluente se colectó para ser empleado en los sistemas de copigmentación (esquema general en la Figura 2.1). La determinación de la concentración de fenólicos en dichos extractos, antes y después del tratamiento se describe en la siguiente sección. El proceso de regeneración de las resinas sugerido por el fabricante, es emplear soluciones de HCl ó NaCl 1 N para la resina fuerte y NaOH ó NH4OH 1N para la resina débil.

Figura 2.1 Esquema general de modificación de extractos de tomillo por cromatografía

aniónica. Flujo de 4 mL/min.

Extracto crudo de Tomillo Resina aniónica débil WA30 (1.3 g) Extracto WA30 Extracto PA308 6 mL 6 mL Resina aniónica fuerte PA308 (1.3 g)

2.2.2.3 Caracterización espectrofotométrica de extractos fenólicos

2.2.2.3a Determinación de Fenólicos totales por el método de Folin-Ciocalteau

La determinación del contenido de fenólicos totales en los extractos de tomillo se realizó mediante una modificación reportada por Vinson et al. (2001) del método de Folin- Ciocalteau (Swain y Hillis, 1959). Siguiendo dicho método se adicionó a 0.1 mL de muestra, 1 mL de una dilución 1:9 en agua bidestilada del reactivo de Folin-Ciocalteau, se agitó y se dejó reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. Inmediatamente se realizaron lecturas de absorbancia a 750 nm. en un espectrofotómetro marca Beckman modelo DU 650 (Fullerton, CA., E.U.A.). La conversión de absorbancia a concentración se obtiene mediante la ecuación de regresión de la curva de calibración efectuada con ácido gálico, los fenólicos totales se expresan como equivalentes de ácido gálico (EAG).

2.2.2.3b Determinación del perfil de compuestos fenólicos por el método de Glories

Una determinación parcial del perfil de compuestos fenólicos presentes en el extracto de tomillo se llevó a cabo a través del método de Glories reportado por Mazza, et al. (1999) en el cual se mide la absorbancia de la muestra a las longitudes de onda promedio para los diferentes tipos de compuestos fenólicos. El método consistió en colocar 0.25 mL de muestra o estándar en un tubo con 0.25 mL de HCl 0.1 % en metanol 95 % y 4.5 mL de HCl 2 %, se mezcló y dejó reposar por 15 minutos antes de realizar mediciones de absorbancia en un espectrofotómetro marca Beckman modelo DU 650 (Fullerton, CA., E.U.A.) a 280 nm para fenólicos totales, 320 nm para flavonas, y 360 nm para flavonoles. La calibración del método se realizó empleando ácido gálico como estándar para fenólicos totales, ácido caféico para flavonas y quercetina para flavonoles, los primeros dos preparados en soluciones de metanol 10 % y el último en metanol 100%.

2.2.2.4 Evaluación de los extractos modificados como sustratos de PPO

La medición de la capacidad de los copigmentos de actuar como sustratos de polifenoloxidasa, fue determinada por medición espectrofotométrica de la actividad de dicha enzima usando una modificación del ensayo descrito por Stauffer (1989) y Worthington (1993). En una celda espectrofotométrica de 3 mL de capacidad se colocaron 2.8 mL de buffer de fosfatos pH 6.5, I= 0.05 y 0.1 mL de la solución de copigmento a probar; esta disolución se mantuvo en un baño a temperatura controlada a 30ºC para equilibrar su temperatura durante 5 minutos. Se utilizó un extracto de polifenoloxidasa comercial (E.C. 1.14.18.1) con una actividad de 300 U/mL, la cual se colocó en el baño a 30ºC para equilibrar su temperatura un minuto antes de realizar el ensayo. Se empleó un espectrofotómetro marca Beckman modelo DU 650

(Fullerton, CA., E.U.A.), equipado con portacelda para control de temperatura a 30ºC. La celda fue colocada en el espectrofotómetro y se añadió 0.1 mL de la solución de enzima. Las lecturas de absorbancia fueron realizadas a 420 nm por un periodo de 5 minutos en intervalos de 15 segundos entre mediciones. La actividad enzimática se determinó empleando la pendiente de la recta obtenida de las gráficas de absorbancia contra tiempo. La unidad de actividad enzimática se definió como un cambio de 0.001 en el valor de la absorbancia por minuto, bajo las condiciones del ensayo (Rocha y Morais, 2001).