La vida media estimada para el receptor silvestre maduro de LDL es de 10.9 ± 0.2
horas y este valor concuerda con el descrito en fibroblastos humanos por Casciola et al. (1989),
y Grant et al. (1990), de 11 y 10.7 h, respectivamente. Sin embargo, la vida media de la proteína
mutada (C358Y) es de 5.3 ± 0.6 h, por lo que la mutación C358Y afecta también a la estabilidad del receptor de LDL una vez alcanzada la forma madura, haciendo que se degrade casi 2 veces más rápido que la proteína silvestre. Por tanto, la mutación C358Y disminuye la actividad y la estabilidad del receptor.
La degradación del receptor de LDL C358Y maduro se ve inhibida en un 87% en presencia de los inhibidores de lisosomas. En cambio, en presencia de lactacistina apenas se ve afectada. Por tanto, los proteasomas no parecen intervenir en la degradación de la forma madura del receptor de LDL mutado(ver Figura 34 de Resultados), siendo la vía lisosomal la responsable del rápido recambio de este receptor maduro mutado. Teniendo en cuenta que esta mutación se encuentra en el segundo dominio de homología con el factor de crecimiento epidérmico, al que se le adjudica una función reguladora, la mutación C358Y podría estar
afectando a la capacidad del receptor de desligarse de la LDL cuando disminuye el pH en el
endosoma (Davis et al., 1987), ya que en condiciones normales se separa de la LDL cuando el
pH del endosoma es menor de 6 (Rudenko et al., 2002). De esta manera, el receptor de LDL
mutado acompañaría a las LDL hasta los lisosomas y se degradaría con ellas. Esto explicaría la vida media tan corta que presenta la forma madura mutante con respecto al receptor de LDL silvestre e indicaría que la mutación C358Y, además de ser de Clase 2B, es también de Clase 5.
Se ha postulado que la degradación de receptor de LDL silvestre ocurre por una vía no lisosomal en base a resultados negativos obtenidos empleando inhibidores lisosomales (Casciola et al., 1989; Grant et al., 1990; Hare, 1990; Shite et al., 1990). Los resultados obtenidos con inhibidores muestran una aceleración en la degradación del receptor maduro de LDL en
presencia de NH4Cl, resultado que otros autores han encontrado también en fibroblastos
humanos en presencia de ligando (Grant et al., 1990); en este punto hay que señalar que
nuestros ensayos están realizados en crecimiento exponencial con suero y, por tanto, en presencia de LDL). En presencia de leupeptina, la inhibición es de un 31 %, lo que indica que parte del receptor llega a lisosomas, pero esta vía por sí sola no justifica la degradación del receptor, ya que un 70 % escapa a la inhibición de proteasas lisosomales. Este porcentaje de receptor que no es sensible a inhibidores lisosomales, sí lo es a lactacistina, ya que la inhibición encontrada es del 74 %. Esto concuerda con los resultados de otros autores en líneas celulares derivadas de hepatocitos, donde, en presencia de lactacistina y en condiciones de estado estacionario (Miura et al., 1996), observan un incremento en los niveles de receptor, aunque, debido al procedimiento experimental empleado, no pueden determinar qué porcentaje del receptor silvestre se degrada por esta vía. Cuando se emplean conjuntamente la leupeptina y la lactacistina, la inhibición de la degradación es de un 90 %. Es decir, los efectos de los inhibidores son razonablemente aditivos. Por otro lado, nuestros resultados muestran que,
cuando se emplean juntos el NH4Cl y la leupeptina, la aceleración que produce el primero de
los inhibidores se compensa con el efecto del segundo y no se aprecia acumulación del receptor. Ésto explicaría que otros autores no hayan visto ningún efecto sobre la degradación del receptor con inhibidores lisosomales (Casciola et al., 1989).
Por tanto, puede concluirse de estos resultados que el receptor silvestre se degrada principalmente por la vía del proteasoma, aunque una proporción del mismo es degradada por
lisosomas. Diversos trabajos se han centrado en el estudio de la degradación de receptores
presentes en la membrana plasmática y que experimentan reciclado. Melman et al. (2002),
empleando MG132 y lactacistina, han concluido que 19 de los residuos presentes en la cola citoplasmática de la proteína relacionada con el receptor de LDL (LRP) contienen señales implicadas en el reciclado del receptor como, probablemente, en su degradación mediante el proteasoma. Además, mediante el empleo de proteínas truncadas, concluyen que el fenómeno de la endocitosis y el de la degradación mediante el proteasoma suceden de forma independiente. Comparando la secuencia de la cola citoplasmática del receptor de LDL con el segmento citoplásmico de 19 residuos de la LRP, hemos observado que ambos presentan la secuencia NPVY; ésta es una secuencia de internalización, que recientemente se ha mostrado que está implicada en la interacción del receptor de LDL con ARH (proteína cuya alteración causa Hipercolesterolemia Autosómica Recesiva), un tipo de proteína adaptadora que
presumiblemente acopla al receptor de LDL con la maquinaría de endocitosis (Cohen et al.,
2003). En lo que respecta a su degradación por el proteasoma, la comparación no nos permite concluir que existan otras secuencias homólogas entre ambas que comprendan más de 2 residuos consecutivos.
Nuestros resultados suponen, por tanto, una cooperación de las dos principales vías degradativas en la degradación de una proteína específica. Además, una mutación puntual (C358Y) puede determinar que la vía de degradación del receptor cambie ya que en el caso del receptor mutante (C358Y) la vía degradativa pasa a ser mayoritariamente lisosomal. Es decir, los dos sistemas proteolíticos mayoritarios cooperan en la degradación de una misma proteína y su importancia relativa puede variar por mutaciones puntuales en la secuencia de la misma.
OBJETIVO 1
1. En hígado de rata y en células cultivadas de mamífero los proteasomas se localizan sobre todo en el citosol, pero también en el núcleo y asociados a la cara externa de la membrana del retículo endoplásmico.
2. Aunque los diferentes proteasomas se encuentran en todas esas localizaciones, la proporción de proteasomas 26S, inmunoproteasomas y proteasomas PA28 asociada al retículo endoplásmico es mayor que la de los proteasomas 20S. Los inmunoproteasomas y los proteasomas PA28 se encuentran en cantidades pequeñas en el núcleo.
3. Las subunidades del proteasoma 20S y de sus complejos reguladores no se encuentran libres en las células en cantidades apreciables.
OBJETIVO 2
4. Los inhibidores MG132 y ALLN, que han sido utilizados ampliamente como inhibidores específicos de los proteasomas, son también inhibidores muy eficaces de las vías proteolíticas lisosomales.
5. Las principales vías proteolíticas en la degradación intracelular de proteínas de vida media corta y larga son los proteasomas y los lisosomas, que son responsables de un 80% o más de toda la degradación.
6. Las distintas vías proteolíticas se activan o inhiben de manera diferente en las diferentes condiciones de crecimiento. Así por ejemplo, la macroautofagia se activa en ausencia de suero y/o de aminoácidos y su importancia disminuye en el ayuno prolongado, mientras que otras vías lisosomales diferentes a la macroautofagia se activan en células confluentes y su importancia aumenta en el ayuno prolongado. En cuanto a los proteasomas, son más activos en ausencia de suero probablemente debido a un incremento en la cantidad de proteínas ubicuitiladas y son menos activos en confluencia debido a la sustitución del complejo regulador 19S y de las subunidades intercambiables del proteasoma 20S por el complejo regulador PA28 y las subunidades del inmunoproteasoma, respectivamente.
OBJETIVO 3
7. La mutación C358Y del receptor humano de LDL retrasa su maduración provocando que parte de la forma precursora sea degradada por lisosomas. 8. La forma madura del receptor humano de LDL se degrada mayoritariamente
por proteasomas, pero también por lisosomas.
9. La mutación C358Y disminuye la estabilidad del receptor humano maduro de forma que su degradación transcurre a través de una vía casi exclusivamente lisosomal.
1. MATERIAL