Los estudios genéticos se llevarán a cabo sobre el ADN y el ARN extraídos de los linfocitos de las muestras de sangre periférica obtenida de cada participante en este proyecto. Este material se empleará para:
1. Estudios de perfiles de expresión. 2. Secuenciación del exoma. 3. Estudios de asociación.
4. Análisis exhaustivo de determinados genes.
Toma de muestras:
Obtendremos de cada sujeto unos 20 mL de sangre que irán repartidos en tres tubos con el fin de obtener ADN, ARN y células blancas. Las muestras de sangre se obtendrán en:
1. Tubos con EDTA (para la obtención del ADN genómico total). 2. Tubos PaxGene (para la obtención del ARN).
3. Tubos con heparina (para la obtención de células blancas).
El ADN genómico total y el ARN total se obtendrán utilizando sistemas de purificación automatizados (Maxwell 16 Purification system, de Promega; MaNaPure system, de Roche) y/o manualmente (DNA isolation kit for mammalian blood, de Roche). Las células blancas se obtendrán mediante gradiente de densidad utilizando hiotopaque-1077 (Sigma). El ADN genómico y el ARN así obtenidos se utilizarán en los diversos estudios genéticos mientras que las células blancas se almacenarán como reservorio con el fin de poderlas utilizar en posteriores estudios que requieran la obtención de proteínas o la obtención de más material genético (según las necesidades que se deriven del desarrollo del proyecto).
Se establecerá la rutina que se deberá emplear en la adquisición y manejo de las muestras. La información se introducirá en una base de datos informática (utilizando un código elaborado a tal fin) que permitirá la recuperación rápida y sistemática de todos los datos.
Toda la información referente a la identidad de los pacientes será considerada confidencial a todos los efectos y se tratará conforme establece la Ley Orgánica 15/1999 de 13 de diciembre (de “Protección de Datos de Carácter Personal”) y en el marco de la Ley 14/2007, de 7 de julio (“de Investigación Biomédica”). La identidad no será revelada ni divulgada excepto cuando sea necesaria para su tratamiento, seguimiento o seguridad. La información obtenida de los sujetos de estudio serán siempre mantenidos en absoluta confidencialidad. Los datos generados no estarán disponibles para otras personas que no sean los investigadores implicados en el trabajo. Todas las personas participantes en el estudio o sus representantes legales (en el caso de que la persona sea mentalmente discapacitada) serán apropiadamente informadas, oralmente y mediante un documento informativo que se le entregará (Anexo VI.1)
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y deberán firmar. Igualmente, deberán firmar un consentimiento que previamente habrá sido aprobada por el comité ético del centro (Anexo VI.2).
1) Estudios de perfiles de expresión
El estudio de los perfiles de expresión génica se llevará a cabo mediante el análisis del transcriptoma de cada paciente. Para ello se empleará el GeneChip Human Transcriptome Array 2.0 (Affymetrix). Los datos obtenidos se analizarán mediante el software Affymetrix® Transcriptome Analysis Console (TAC).
2) Secuenciación del exoma
La metodología básica será por procedimiento de enriquecimiento del exoma de cada paciente con métodos establecidos como Haloplex o SureSelect (Agilent Technologies). Brevemente, a partir del ADN genómico, éste se fragmenta y se ligan los adaptadores de secuenciación y códigos genéticos identificativos (index o barcotes, uno por muestra) en los fragmentos producidos, obteniendo así la librería de secuenciación. Posteriormente se lleva a cabo un enriquecimiento de la librería. La fracción enriquecida se procesará en un secuenciador masivo.
La secuenciación masiva (tanto la secuenciación dirigida de los genes de interés o targeted-sequencing como la del exoma completo) se llevará a cabo en servicios con reconocida experiencia en el empleo de esta técnica. Este servicio incluye la secuenciación de los exomas de interés y el análisis bioinformático de los datos (tipo BaseCaller) que permite cartografiar los resultados frente al correspondiente genoma de referencia con el fin de obtener un listado de SNPs e INDELs (pequeñas inserciones y deleciones) y determinar si un cambio concreto es nuevo o conocido. Además se llevará a cabo un análisis bioinformático más especializado con el fin de detectar la cobertura y localización de posibles deleciones exónicas. Con los datos obtenidos de la secuenciación de cada caso se generará una base de datos. Se establecerán procedimientos de cartografiado de fragmentos, anotación de variantes y catalogación de cambios únicos.
Panel de genes (para la secuenciación dirigida de genes de interés o targeted-sequencing): Nos proponemos estudiar aquellos genes que se han descrito en los loci PARK (SNCA, LRRK2, FBXO7, PINK1, PRKN, DJ1, HTRA2, UCHL1, ATP13A2, VPS35, PLA2G6, GIGYF2, EIF4G1) así como el gen GBA (que se ha descrito como un importante factor de susceptibilidad para desarrollar enfermedad de Parkinson). Para ello, llevaremos a cabo la secuenciación de los exones codificantes de todos estos genes así como de sus extremos 5’-UTR y 3’-UTR. Se incluirán todos los exones que den lugar a las distintas isoformas de las proteínas. Además se incluirán los nucleótidos intrónicos adyacentes a ambos extremos de cada uno de los exones.
Catalogación de los cambios obtenidos y selección de los SNPs candidatos:
Para identificar las variaciones genéticas candidatas a ser específicas de la enfermedad de Parkinson de entre todos nuestros datos de secuenciación del exoma, seleccionaremos los nuevos SNPs no sinónimos, los que afecten al sitio de splicing y aquellas deleciones/inserciones
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pequeñas presentes en pacientes con enfermedad de Parkinson. También seleccionaremos las mutaciones y SNPs conocidos, funcionalmente relevantes.
Análisis del efecto de las variaciones encontradas a nivel de función de la proteína y conservación:
Con el fin de evaluar o confirmar el papel de las variantes genéticas en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson, realizaremos un análisis in silico con el fin de obtener la información sobre su consecuencia a nivel funcional y de conservación.
Análisis in silico:
La conservación evolutiva de las variaciones se examinará mediante el uso del valor “phyloP” (phyloP score) extraído de la tabla “PhyloP46wayAll” del buscador “UCSC Table” (http://genome.usc.edu/cgi-bin/hgTables). Además, definiremos las diferencias físicoquímicas entre las variaciones utilizando el valor “Grantham”.
En caso de SNPs no sinónimos, el efecto patogénico de los cambios de aminoácido sobre la estructura proteica tridimensional y sus consecuencias sobre la función de la proteína se predecirá utilizando los servidores: Polyphen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu.pph2/), MutPred v.1.2 (http://mutpred.mutdb.org/) y Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org/).
El servidor MutPred se ha diseñado para modelar el efecto de un cambio de aminoácido dentro de una proteína dando la probabilidad de que un cambio sea deletéreo para la función de la proteína; pero además, puede generar también la hipótesis de cómo un cambio de aminoácido afecta a los mecanismos moleculares subyacentes responsables de la patogénesis de la enfermedad.
La predicción de los efectos de las variaciones encontradas sobre las señales de splicing se hará utilizando diferentes herramientas:
1. Softberry (http://linux1.softberry.com/berry.phtml).
2. NNSPLICE 0.9 (SPLICE; http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html). 3. SpliceView (http://zeus2.itb.cnr.it/~webgene/wwwspliceview.html). 4. HSF (http://www.umd.be/HSF/).
5. Skippy (http://research.nhgri.nih.gov/skippy/).
6. The AASsites pipeline (http://genius.embnet.dkfz-heidelberg.de/menu/biounit/open- husar/).
7. FastSNP (http://fastsnp.ibms.sinica.edu.tw/).
Como controles de nuestros análisis bioinformáticos incluiremos (en caso de que sea factible) aquellas variaciones previamente descritas como patogénicas.
3) Estudios de asociación en genes candidatos:
Con el fin de determinar si las variaciones potencialmente patológicas se presentan con mayor frecuencia en la enfermedad de Parkinson y, por tanto, suponen un factor de riesgo, llevaremos a cabo estudios de asociación.
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El genotipaje lo realizaremos mediante:
a) Discriminación alélica: utilizando “TaqMan SNP genotyping Assays" (Applied Biosystems, Foster City, USA) in a Light-Cycler 480 (Roche).
b) IplexGold con tecnología MassArray (Sequenom): basada en la detección de los productos de la reacción de discriminación alélica mediante MALDI-TOF. Esta estrategia permite genotipar una media de 24 variaciones en cada reacción.
Aquellos pacientes con enfermedad de Parkinson que tengan un pariente de primer grado también afecto se utilizarán para identificar variaciones con un efecto neuropatológico sustancial. La segregación de las variaciones se determinará en todos los miembros de la familia disponibles (afectos y no afectos) para confirmar alelos de susceptibilidad y establecer correlaciones genotipo-fenotipo. El estudio de pacientes de enfermedad de Parkinson y los miembros de sus familias sin enfermedad de Parkinson pero quizás portadores de mutaciones genéticas podría dar una información muy importante sobre los estadios tempranos de la enfermedad. Esto podría ayudar a identificar características diagnósticas tempranas, o factores de riesgo, que podrían predisponer a la enfermedad. Además, esto podría revelar potenciales biomarcadores de la enfermedad que fuesen útiles en los estudios clínicos.
4) Análisis exhaustivo de genes.
Para llevar a cabo el estudio exhaustivo de un gen determinado (con el fin de determinar/confirmar la presencia de variaciones con una implicación patológica) realizaremos su análisis mediante:
- HRM (high resolution meeting) en una LightCycler 480 (Roche).
- Secuenciación directa en un analizador genético ABI3500 (Applied Biosystem) en ambas direcciones.
- Análisis del ARNm. Para el análisis del ARNm realizaremos una retro-PCR utilizando un kit comercial. El cDNA obtenido se utilizará en la amplificación y cuantificación relativa mediante PCR a tiempo real.
Procedimiento en cada centro participante
Se realizará la extracción de 20 ml de sangre (3 tubos, descrito en la página 71) a cada sujeto participante para estudios genéticos en los centros participantes en esta parte del protocolo. Se almacenarán las muestras congeladas en cada centro hasta realizar un único envío de todas las muestras juntas en hielo al laboratorio 104-Trastornos del Movimiento-Instituto de Biomedicina de Sevilla-Hospital Universitario Virgen del Rocío (Biobanco del Sistema Sanitario Público de Andalucía). Dichas muestras se almacenarían a la espera de poder conseguir financiación para su posterior análisis (unos 600 euros por muestra).
Se realizará también la extracción de otros 2 tubos de 1mL de suero y 2 tubos de 1 mL de plasma EDTA a cada sujeto participante en los centros participantes en esta parte del protocolo. Dichas muestras serán almacenadas congeladas en cada centro y enviadas
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posteriormente junto con las muestras para estudios genéticos. Dicho material biológico se conservará con el objetivo de poder ser utilizado en el futuro con algún fin (por ejemplo, testar un nuevo marcador sérico no contemplado en el protocolo actual del proyecto).
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