Estudio químico de los compuestos de interés.

En la tabla 8 y figura 26 se presenta el análisis químico cualitativo realizado a los compuestos de interés (C1, C2 y Fr. Activa Original), mediante cromatografía en capa fina (CCD), para investigar la presencia de metabolitos secundarios, empleándose como FE:

Compuesto No. 1 2 Fr. Activa Original DMSO AZM

S. mutans 6.5 6.2 8.5 0 15

RP-18 y FM: MeOH: CH2Cl2 (9:1) y el índice de espuma. Se evidencia la presencia de

terpenos, esteroides y saponinas.

Figura 26. Pruebas Químicas Cualitativas en CCD A) Prueba de Dragendorff. B) Prueba de Lieberman-Bürchard. C) Prueba de Börntrager D) Molibdato de Amonio. Positivas para Terpenos y Esteroides.

Prueba Resultado

Lieberman-Bürchard (Triterpenos y esteroides) Positivo Molibdato de Amonio (Diterpenos) Positivo

Börntrager (Antraquinonas) Negativo

Dragendorff (Alcaloides) Negativo

Cloruro Férrico (FeCl3) (Fenoles) Negativo

Indice de Espuma Positivo

Tabla 8. Pruebas químicas cualitativas en CCD e Índice de Espuma de los compuestos de interés.

A B C D

C1 C2 Fr. A.O. _{C1 C2 Fr.A.O.} C1 C2 Fr.A.O. C1 C2 Fr.A.O.

7. DISCUSIÓN

Colombia es un país destacado en el mundo por sus recursos naturales, la gran variedad de flora que se encuentra en ella, ha permitido el desarrollo de la medicina artesanal. (Rojas et al., 2006).Las culturas indígenas marcaron la pauta en el uso de las plantas, basados en la experiencia y el conocimiento empírico, lograron obtener sustancias útiles para la curación y tratamiento de enfermedades. Este conocimiento que ha permanecido durante el tiempo y aun es utilizado como medicina alternativa, ha creado interés en muchos para seguir con la búsqueda de nuevas fuentes medicinales que ayuden a disminuir la incidencia y prevalencia de enfermedades que aquejan a la humanidad, y mejor aún teniendo como fuente las plantas, que por su eficacia, accesibilidad y costo, se ha establecido como la mejor opción para desarrollar medicamentos.

La caries dental aun es considerada un problema de salud pública que afecta a muchos países incluyendo Colombia. El desequilibrio entre las especies microbianas y diferentes factores externos como la alimentación, la higiene oral y el nivel socio-económico influyen en el desarrollo de esta patología. La microflora oral es un sistema complejo que contienen una gran variedad de especies bacterianas. Entre los principales microorganismos asociados a la caries dental son, en orden de importancia: S. mutans, en menor proporción S. sobrinus, y especies de Lactobacillus y Actinomyces. (Shigeyuki H. and Hutton D. 1980). Está claro que el S. mutans cumple un papel importante en la patogénesis de la caries dental, su prevención debe estar encaminada en la inhibición de la adhesión de este microorganismo a la superficie del diente y la inhibición de la glusiltransferasa para formar glucano insoluble en agua, el cual es esencial para la misma adherencia. Al tener presentes estos dos mecanismo de acción de la bacteria nos hace plantear estrategias eficaces para la disminución o eliminación de la misma en cavidad oral, ya que los tratamientos dentales usualmente son costosos y de difícil acceso, especialmente en países en desarrollo como Colombia (Napimoga et al., 2005)

Muchos estudios se han encaminado a la identificación de compuestos o metabolitos secundarios de productos naturales, contra Streptococcus mutans, gran variedad de familias de plantas han demostrado actividad inhibitoria, como las fabáceas (Katsura et al., 2001), familia Moraceae (Park et al., 2003), familia Clusiaceae (Almeida et al., 2007), familia

Theaceae (Tsai et al., 2007), familia Rubiaceae (Jayasinghe et al., 2002) , familia Vitaceae

(Rivero, et al., 2008), familia Asteraceae (Yatsuda, et al., 2005), familia Zingiberaceae ( Xiao, et al., 2006), entre otras. Una familia que en su gran mayoría encontramos en Colombia es la Rubiceae, que contienen sustancias comunes que poseen actividad biológica, especialmente del género Isertia, lo que da una razón para ampliar el estudio de este género el cual presenta un amplio espectro de inhibición, por medio de la búsqueda de técnicas asequibles y eficientes para encontrar sustancias antimicrobianas.

En este estudio se realizaron dos métodos para la obtención de fracciones y subfracciones, de las cuales se obtuvieron resultados positivos para la actividad antimicrobiana. Durante la realización del Método 1: Cromatografía en Columna al Vacío CCV, se demostró actividad inhibitoria en las fracciones de MeOH y MeOH:CH2Cl2 (1:1). La columna se eluyó con

volúmenes de 120 ml aproximadamente. Las fracciones que presentaron actividad fueron obtenidas durante los últimos volúmenes de solventes que se agregarón a la columna, es decir de MeOH y MeOH:CH2Cl2 (1:1), comparándose estos resultados con estudios

anteriores de I. laevis (Alvarado et al., 2008), las fracciones que presentaban inhibición sobre las bacterias, se encontraban en la fracción de MeOH:H2O, ya que se obtuvieron con cuatro

veces el volumen que se utilizó en el presente estudio, es decir, los mismos compuestos se lograron obtener solo al final de la marcha de la columna lo que difiere al estudio anterior.

Ahora bien, con el Método 2: Fraccionamiento líquido/líquido continuo, se logró extraer la fracción activa, sin embargo esta no se encontró en la misma fase móvil utilizada en la primera metodología, ya que se extrajo en Diclorometano (Fracción CH2:Cl2). Esto nos indica

que la fracción antimicrobiana tiene sustancias polares y no polares. Con la Cromatografía en Columna al Vacío CCV, las fracciones con actividad se extrajeron con disolventes con mayor polaridad como el Metanol y con el fraccionamiento líquido/líquido Continuo, se obtuvieron con disolventes de mediana o baja polaridad como lo es el Diclorometano. La cantidad de volúmenes utilizados influyó en que se encontrará la fracción activa en diferentes solventes, pues a diferencia del método 1, se utilizaron hasta 2000 ml de solvente, logrando una extracción más eficiente y relativamente rápida.

El fraccionamiento líquido/líquido proporcionó una técnica eficaz en la obtención de la fracción activa a mayor cantidad y debido a su bajo costo, ya que solo es necesaria la utilización de solventes y calor, esto representa una opción económica para la extracción de sustancias, lo que podrá permitir que esta técnica puede ser implementada a nivel industrial, debido a que los materiales utilizados no cambian, ni modifican las sustancias que se quieren encontrar, debido a su bajo procesamiento, contrario al método de Cromatografía en Columna al Vacío CCV, donde se obtiene poca cantidad de extracto, con materiales como el RP-18, el cual no se utiliza industrialmente, por su costo y viabilidad. Sin embargo, CCV permite obtener fracciones con un grado de mezcla menor, lo que no se puede esperar del fraccionamiento liquido/líquido donde el grado de mezcla de las sustancias extraídas es mucho mayor, lo que se logro evidenciar en el monitoreo con CCD (FE: RP-18, FM: MeOH:CH2Cl2 9:1)

Al evaluarse las fracciones obtenidas de cada método, se obtuvieron mejores resultados con la técnica Difusión en pozo, pues los extractos lograban una mayor difusión en el agar a diferencia de la técnica Difusión en disco que como lo reporta More et al., 2008, esta proporciona buenos resultados, sin embargo, al evaluarse la actividad antimicrobiana de las fracciones de este trabajo, parte del mismo aplicado al papel filtro esterilizado, no permitió su correcta difusión y es posible que el mismo papel generará interferencias en los resultados. Contrario a los presentados por el método Difusión en pozo que según autores como Galvin et al., 1999, permiten una fácil difusión y contacto completo del extracto con el agar inoculado con las bacterias en estudio.

Al obtenerse resultados positivos, similares en el porcentaje de inhibición tanto para S. mutans ATCC 25175 así como para S. sobrinus, nos hace pensar que existan compuestos presentes en las fracciones que in vitro, pueden ser los responsables de interferir en los factores de virulencia y por ende afectar la sobrevivencia de estos microorganismos, como lo confirma Almeida et al., 2007, por lo que creemos de importancia evaluar estos compuestos in vivo.

Las fracciones activas se evaluaron a concentraciones de 0,5 a 20 mg por pozo, con las fracciones del Método 1 se evidenciaron resultados positivos a 2 mg por pozo, la fracción con actividad antimicrobiana del Método 2 mostró resultado positivo a 1 mg por pozo. Las subfracciones se obtuvieron a partir de la fracción Diclorometano (CH2:Cl2) debido a la

cantidad que se tenía, contrario a las fracciones del Método 1, del cual se obtuvo poca muestra. En la evaluación de estas subfracciones se evidencio excelente inhibición en la

Subfracción 2, monitoreada por cromatografía RP-18 corrida con MeOH:CH2Cl2 (9:1) dos

compuestos que se destacaban visualmente, y adicionalmente mostraba menor grado de mezcla. La Subfracción 3 produjo inhibición en menos proporción, ya que contaba con cierta cantidad de clorofila, lo que nos hace pensar que este componente se comporta como un interferente en la acción antimicrobiana de la fracción.

Las Fracciones activas se evaluaron por medio de Bioautografías, las cuales se revelaron con Sal de tetrazolium o MTT, para permitir la visualización de zonas de inhibición, por medio de la reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol por parte de las bacterias viables, produciendo formazan, el cual se caracteriza por una coloración azul-púrpura, indicándonos la presencia de crecimiento bacterial donde el extracto no produjo ninguna acción antimicrobiana. La Bioautografía es entonces un método que nos permite, saber si los compuestos que se separan por medio de la cromatografía, tienen acción por si solos o es necesaria su unión para producir un efecto inhibitorio significativo. Los resultados presentados nos demuestra que la acción antimicrobiana se da por los dos compuestos de interés sin embargo la unión de los dos produce mayor efecto inhibitorio.

El método MTT, no solo fue aplicado a las Bioautografías, sino también se implemento en la visualización de los halos de inhibición, producidos por los extractos evaluados por medio del Método de Difusión en Pozo, permitiéndonos una fácil lectura del diámetro de los halos.

Todas las fracciones activas fueran monitoreadas de la misma forma, comparadas con la subfracción activa del estudio anterior de la misma planta, en estas cromatografías se logro observar que todas las sustancias poseen en común dos compuestos con Rf de 0,42 y 0,23, confirmándose que se logró extraer los mismos compuestos del estudio anterior por dos diferentes métodos.

A partir de esto se llega a la separación de los compuestos de interés, obteniendo tanto el compuesto 1 como el compuesto 2 y su mezcla. La evaluación microbiológica de estos compuestos separados, nos demuestra que tienen la capacidad de inhibir las bacterias, la cual se aumenta con la interacción de su mezcla. Al observarse la excelente acción antimicrobiana de estas sustancias, se realizó estudio químico cualitativo, que demostraron que los compuestos separados contienen Terpenos y esteroides lo que concuerda con Murphy 1999, quien reporta la acción inhibitoria de estos metabolitos sobre bacterias, por medio de la interrupción de la formación de la pared celular de las mismas. De igual forma

bacterias Gram-positivas como bacterias Gram-Negativas según lo reportado por Sparg et al., 2004.

8. CONCLUSIONES

La planta Isertia laevis ha sido objeto de pocos estudios microbiológicos, donde se evidencia su capacidad antimicrobiana en otras enfermedades, diferentes a la caries dental, dando un razón para seguir su estudio químico y microbiológico, que permita el desarrollo de nuevos fitomedicamentos.

Se logró obtener fracciones con actividad antimicrobiana de las hojas I. laevis por medio de dos métodos diferentes: Cromatografía en Columna al Vacío CCV y Fraccionamiento Liquido/Liquido Continuo.

Al separar las fracciones activas se determinaron dos compuestos con Rf de 0,37 y 0,51, presentados también por la subfracción inhibitoria del estudio anterior de la planta (Alvarado et al., 2008), lo que permite concluir que estas contienen los metabolitos que generar el efecto antimicrobiano.

Los compuestos separados de las fracciones activas, por si solos tienen actividad inhibitoria, sin embargo, en sinergia aumentan su efecto sobre las bacterias evaluadas.

Se determinó que con la CCV se extrajeron las fracciones activas en poca cantidad pero con un menor grado de mezcla, es decir que al ser evaluadas con bajas concentraciones se obtuvieron excelentes resultados de inhibición. Con el fraccionamiento líquido/líquido la extracción de la fracción activa se obtuvo con un grado de mezcla mayor, sin embargo la cantidad de extracto comparado con la cantidad que se extrajo con el Método 1. Este grado de mezcla, interfiere en la acción antimicrobiana del mismo extracto (Presencia de clorofilas), lo cual disminuye la actividad inhibitoria, por lo tanto es necesario realizar su respectiva purificación o separación de compuestos.

La concentración mínima inhibitoria del método 1 fue 2 mg por pozo y la concentración inhibitoria del método 2 fue 1 mg por pozo.

El fraccionamiento líquido/líquido puede ser la mejor opción para extraer industrialmente extractos de plantas, debido a su bajo costo y poco procesamiento de las sustancias.

Se concluye también que el método MTT dio excelentes resultados para visualizar de manera fácil los halos de inhibición producidos por las fracciones evaluadas en el método difusión en pozo, permitiendo la lectura correcta del diámetro de los halos.

9. RECOMENDACIONES

Se recomienda realizar pruebas microbiológicas de las fracciones activas en otras cepas bacterianas (Mycobaterias) asociadas a otras patologías humanas.

Es importante evaluar el efecto tóxico en células humanas sanas de las fracciones y de igual forma evaluar el efecto farmacológico, toxicológico y realizar estudios clínicos de la fracción activa.

Se recomienda aislar, purificar e identificar algunos de los componentes de la mezcla para posteriormente cuantificar su contenido y estandarizar la fracción activa

Se sugiere buscar sustancias bioactivas que tengan efecto antimicrobiano en otras plantas de la familia Rubiaceae.

Sería de gran importancia determinar el efecto biológico de las fracciones activas sobre las bacterias en estudio y otras de importancia clínica.

Se recomienda el uso del MTT para pruebas microbiologías en la evidencia de halos de inhibición.

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