ESTUDIOS DE LA BIODISPONIBILIDAD DE ELEMENTOS TRAZA BASADOS EN LA DETERMINACIÓN DE LOS MISMOS

EN LOS DIALIZADOS, BAJO CONDICIONES FISIOLÓGICAS SIMULADAS

De igual forma que en los métodos basados en la solubilidad, en los estudios de dializabilidad se simula el proceso de digestión gastrointestinal y posteriormente se separan los elementos traza mediante un equilibrio de diálisis. La proporción de nutrientes que difunden a través de una membrana semipermeable durante la etapa intestinal, se usa como predicción de la biodisponibilidad de un elemento tras el análisis del contenido de éste en el interior del tubo de diálisis. El proceso de diálisis de un soluto a través de una membrana, se basa en la diferencia de concentración del soluto en las disoluciones de ambos lados de la membrana, de modo que habrá una migración del soluto de la disolución en que esté más concentrado a la zona en que esté más diluido. En la diálisis in vitro, la migración del soluto se hace del alimento

que tiene un contenido de elementos traza hacia el interior de la membrana de diálisis (que simula el intestino).

En 1981, Miller y col.17 _{desarrollaron un método de digestión, el cual se puede}

tomar como punto de partida de este tipo de métodos, mediante el cual determinaron la dializabilidad del hierro en alimentos. Este método consiste en una primera digestión (gástrica) ácida con la enzima pepsina; las muestras se mantienen en un baño de agua a 37°C, durante dos horas. En segundo lugar se lleva a cabo la digestión intestinal; varios segmentos de tubo de diálisis se cortan y llenan con 25mL de agua y la cantidad de bicarbonato sódico necesaria para tener un pH igual a 7,5. Estos tubos se introducen en los vasos que contienen las muestras y se agitan a 37°C en un baño de agua, el tiempo necesario para que el pH sea 5 (30 minutos aproximadamente) a continuación se añade la enzima pancreatina y los vasos se mantienen en el baño de agua dos horas. Finalmente, los tubos se lavan con agua y se pesan. La determinación de hierro en el contenido de los tubos (dializados) se llevó a cabo mediante el método de la batofenantrolina. Los resultados obtenidos mediante este método demuestran que existen buenas correlaciones con los objetivos obtenidos mediante estudios “in vivo”. Debido a esta alta correlación este método, desarrollado por Miller, ha sido utilizado como punto de partida por muchos investigadores en sucesivos trabajos.

Shen y col.18_{(1993) aplicaron el método desarrollado por Miller}17 _{para llevar a}

cabo una estimación de biodisponibilidad de selenio en leche de vaca. Posteriormente estos investigadores usaron un método de diálisis en flujo continuo7_,

similar al usado por Minihane y col.8_{, de modo que el dializado se elimina del}

interior de la membrana a medida que transcurre el proceso. Otra importante modificación fue realizar un ajuste gradual del pH (30 min. aproximadamente) antes de la diálisis. Este método fue aplicado para determinar la biodisponibilidad del cinc y calcio de fórmulas basadas en leche de vaca y en proteínas de soja. En 199519 _estos

autores aplicaron de nuevo el método de Miller17 _{con una ligera modificación al}

estudio de la biodisponibilidad de cinc y calcio en leche humana, leche de vaca, de cabra y de oveja. El mismo método lo aplicarían un año más tarde (1996)20 _{con el}

objetivo de estudio de la biodisponibilidad de selenio en leche humana, leche de vaca, de cabra y de oveja, encontrando una mayor biodisponibilidad del selenio en leche humana.

En 1994, Vaquero y col.21 _{llevaron a cabo un estudio de dializabilidad de cobre}

en alimentos consumidos habitualmente en desayunos, usando una modificación del método desarrollado por Miller17_{. Se realizó una digestión gástrica a pH 2 durante}

dos horas y a continuación se llevo a cabo la diálisis durante la etapa de digestión intestinal, con membranas de 12 kDa. Se recogieron los dializados a 30 min., 1, 2, 3 y 4 horas para su posterior análisis.

Pérez-Llamas y col.22 _{(1996) aplicaron el método de Miller}17 _{con ligeras}

modificaciones al estudio del efecto del tipo de cantidad de proteína presente (carne de vaca, cerdo y semilla de soja). La diálisis se llevo a cabo usando tubos de diálisis de 6-8 kDa. Se midieron las concentraciones de hierro y cinc en los dializados.

Alegría y col.23 (1996) usaron un método similar para determinar la biodisponibilidad de cobre, cinc y hierro en fórmulas infantiles suplementadas con diferentes sales de cobre.

En 1998, García y col.6 _{llevaron a cabo un estudio de la dializabilidad de cobre,}

cinc y hierro de distintos tipos de fórmulas infantiles comercializadas en España. En 1999, Roig y col.24 _{usaron la dializabilidad del calcio como una medida de la}

biodisponibilidad del mismo. Estos autores25 _{compararon los métodos de diálisis y}

solubilidad aplicados al estudio de la biodisponibilidad del calcio en leche humana, fórmulas infantiles y leche de vaca. Una comparación de los resultados obtenidos con este método de digestión “in vitro” con los obtenidos mediante métodos “in vivo” mostró que los valores obtenidos por el método de la solubilidad eran más elevados. Además encontraron que en la digestión de las fórmulas infantiles, el método de diálisis era más adecuado, pues mediante el método de la solubilidad no se separa bien la fracción soluble, debido a interacciones que tienen lugar entre la nata, el suero y la caseína.

Jovani y col.26 _{(2000) estudiaron las interacciones entre calcio, cobre, cinc y}

hierro en fórmulas de base láctea y de soja. La biodisponibilidad se estimó en función del porcentaje de dializabilidad mediante un método “in vitro” basado en el método de Miller17_{. Estos autores}27 _{en el 2000 estudiaron también el efecto de las}

proteínas, el fitato, el ácido ascórbico y el ácido cítrico en la dializabilidad del calcio, cobre, cinc y hierro en fórmulas basadas en la proteína de soja.

También usaron este método Guillem y col.28 _{que determinaron la dializabilidad}

de cinc de siete sales diferentes usadas en la fortificación de fórmulas infantiles. Encontraron una mayor dializabilidad en la sal del óxido, ligeramente menor para el gluconato, y la menor con el sulfato.

P. Chaiwanon29 _{(2000) aplicaron el método de Miller}17 _{para el estudio de la}

biodisponibilidad de calcio en leche de soja tras la fortificación de la leche con carbonato cálcico.

Bosscher y col.30 _{(2000) usaron el método de diálisis de flujo continuo}

desarrollado por Minihane8 _{y modificado por Shen}7 _{y lo aplicaron al estudio de la}

biodisponibilidad de calcio, cinc y hierro en fórmulas infantiles y leche humana. Estudiaron también la influencia de la incorporación de carbohidratos digestibles en la biodisponibilidad de esos metales en los alimentos estudiados. Un año más tarde31

desarrollaron un método para la determinación de calcio, cinc y disponible, hierro y cinc biodisponible en fórmulas infantiles después de llevar a cabo un proceso gastrointestinal “in vitro”. Este método emplea las condiciones de la etapa de digestión adaptadas a las condiciones gastrointestinales de niños con edades inferiores a seis meses de edad y llevan a cabo un a diálisis de flujo continuo en la etapa intestinal. Desarrollan igualmente un estudio de la biodisponibilidad de estos elementos a pH 2 y pH 4 en la digestión gástrica. En el 2003 estos mismos autores32

estudian la biodisponibilidad del calcio, cinc y hierro en fórmulas infantiles. Además, estudian como afecta la biodisponibilidad de estos elementos la adición de fibra usando para ello un método de diálisis en flujo continuo, y como afecta a la biodisponibilidad de estos metales la inclusión de la fibra.

E. Peña y col33 _{(2004) desarrollan un método “in vitro” comparando la influencia}

del pH en la biodisponibilidad del cobre en leches maternas y fórmulas infantiles. Estudian como afecta a la primera etapa del proceso gastrointestinal, un pH 2 simulando las condiciones de la digestión gástrica de un adulto y un pH 5 simulando la digestión gástrica de un neonato.

4.2 OBJETIVO

El objetivo de este estudio es comparar la biodisponibilidad del selenio en leche de vaca obtenidas tras la fortificación de la alimentación del ganado con diferentes tipos (inorgánico y orgánico) y niveles de concentración de selenio.

Igualmente se estudiará la influencia del nivel de fortificación de los forrajes empleado en la alimentación de las vacas en la biodisponibilidad del selenio en la leche.

4.3 PARTE EXPERIMENTAL