Estudios ex vivo e in vivo

Los ensayos ex vivo e in vivo se han realizado con la aprobación del Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Barcelona, con arreglo a las regulaciones actuales para el uso y la manipulación de animales de experimentación (Decreto 214/97, Generalitat de Catalunya).

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Para estos estudios se utilizaron conejos machos albinos de Nueva Zelanda con un peso de 1,8 kg a 2,2 kg que no presentaban signos de anomalías o inflamación ocular. Los conejos fueron suministrados por la Granja San Bernado (Navarra). Se utilizaron 3 conejos para cada uno de los ensayos, de acuerdo con los principios de Reducción, Refinamiento y Reemplazo animal (3R) [162, 163] . Durante el tiempo de experimentación los conejos se mantuvieron en el estabulario de la Facultad de Farmacia (Universidad de Barcelona) en condiciones estandarizadas de temperatura (26-28ºC) y humedad relativa (40-60%), con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.

La irritación asociada a la instilación de suspensiones hipo e hipertónicas puede causar parpadeo o lagrimeo, por esta razón se ajustó la osmolaridad (alrededor de 310 mOsm/Kg) a cada una de las formulaciones con 5% (w/v) de glucosa. El pH del fluido lagrimal es uno de los aspectos importantes a tener en cuenta en la preparación de fármacos oculares. En este sentido, se ajustó el pH (7,4) a todas las formulaciones testadas con NaOH 0,1N.

3.22.1 Estudios ex-vivo mediante microscopía confocal laser (CLSM)

Un volumen de 50 μl de cada una de las formulaciones fue administrada en el saco conjuntival del conejo vivo. Después de 2 horas de la instilación, el conejo fue sacrificado. Primero fue anestesiado con xilacina (5mg/kg de conejo) y ketamina (35mg/kg de conejo). Posteriormente se inyectó una sobredosis de pentobarbital sódico (5ml) via vena marginal de la oreja. Se instiló en el ojo del conejo 50μl de una solución de 4% de formaldehido en PBS para fijar la cornea. Una vez extraídas las corneas se lavaron 3 veces con suero fisiológico. Finalmente se adicionaron 50μl de los colorantes de membrana (WGA) y de núcleo (Hoescht).

Las imágenes se tomaron en un microscopio confocal láser de barrido (CLSM). El CLSM utilizado procede de los Serveis Científicotècnics de la

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Universidad de Barcelona, España. Este microscopio es modelo Leika TCS SP2, láser AOTF, con un aumento de 40x/1,25. Las imágenes de fluorescencia fueron obtenidas mediante la excitación de un láser a diferentes longitudes de onda: 364 nm, 488nm y 561nm.

3.22.2 Estudio de tolerancia ocular: Test de Draize

El estudio de irritación ocular primaria se ha llevado a cabo utilizando una modificación del test de Draize (Kay y Calandra, 1962) [164].

Para realizar este ensayo se aplicaron 50 μl de NPs en el ojo derecho del conejo. El ojo contralateral se utilizó como control sin tratar. Tras 1 h de exposición, se realizó la observación de los ojos para valorar las posibles lesiones en la córnea, la conjuntiva y el iris y posteriormente se realizaron lecturas al cabo de 24 y 48 h. Una modificación del test de Draize prolonga el período de evaluación a 72 h (3 días), 96 h (4 días) y 168 h (7 días). Se efectuaron exámenes (por observación directa) del segmento anterior del ojo, constatando las posibles lesiones de la conjuntiva (quemosis, inflamación, exudación, enrojecimiento), del iris y de la córnea (grado de opacidad y superficie afectada). Las lesiones que afectan a cada estructura ocular se evalúan en función del índice de irritación ocular (IO) según un baremo establecido (Tabla 7 y Tabla 8).

Tabla 7. Clasificación de los productos según el índice de irritación ocular máximo (IOMáx). IOMáx CLASIFICACIÓN 0 No Irritante 0-15 Ligeramente irritante > 15-30 Medianamente iritante > 30-50 Irritante > 50 Muy Irritante

73 Tabla 8. Escala de puntuaciones para evaluar del grado de irritación ocular.

ESTRUCTURA LESIÓN EVALUACIÓN PUNNTUACIÓN

CÓRNEA

A) GRADO DE TURBIDEZ U OPACIDAD

 Ausencia de ulceración u opacidad

 Areas difusas de opacidad dispersa  Areas traslúcidas  Areas opalescentes  Completa opacidad B) SUPERFICIE AFECTADA  Ninguna  Un cuarto o menos sin llegar

a cero  Más de un cuarto pero

menos de medio  Más de medio pero menos de

tres cuartos  Más de tres cuartos hasta un

plano entero 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 Puntuación corneal: (AxBx5) Puntuación máxima: ( 80) IRIS  Normal  Pliegues profundos, congestión, inflamación e inyección circuncorneal moderada

 No existe reacción a la luz,

hemorragia, gran destrucción. 0 1 2 Puntuación iridial: Ax5 Puntuación máxima: 10

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ESTRUCTURA LESIÓN EVALUACIÓN PUNNTUACIÓN

CONJUNTIVA

A) ENROJECIMIENTO  Vasos normales  Algunos vasos claramente

inyectados  Enrojecimiento difuso  Gran enrojecimiento difuso B)QUEMOSIS O INFLAMACIÓN

 Ninguna  Alguna  Marcada con transtorno

parcial de los párpados  Párpados más o menos

cerrados  Párpados semicerrados

C) EXUDACIÓN  Ninguna

 Cualquier cantidad anómala  Humectación parpebral y pelos  Humectación periocular 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2 3 Puntuación conjuntival: (A+B+C) x 2 Puntuación máxima: (20)

La puntuación del test de Draize se determinó a partir de la observación visual de los cambios que aparecen en las estructuras oculares. La puntuación total media (PTM) se calculó según la siguiente (Ecuación 13):

PTM = Σ x1(n)/5 + Σ x2(n)/2 + Σ x3(n)/5

(Ecuación 13)

Donde: x1 (n), x2 (n), and x3 (n) son las puntuaciones de la córnea, conjuntiva e iris, y n es el número de conejos utilizados en el ensayo de tolerancia ocular.

75 3.22.3 Eficacia antiinflamatoria

Con el propósito de estudiar las NPs en el tratamiento o prevención de la inflamación ocular producida en la cirugía de cataratas, se indujo la inflamación mediante la aplicación tópica de 0,5% (w/v) de araquidonato sódico (AS) (50 μl) disuelto en PBS (pH 7,4). El protocolo del tratamiento consistió en instilar 50 μl de cada muestra en el saco conjuntival del ojo derecho 30 min después de inducir la inflamación ocular, mientras que el ojo contralateral se utilizó como control sin tratar. En el caso de la prevención, 50 μl de cada muestra se instilaron 30 min antes de inducir la inflamación. La PTM de la inflamación ocular se calculó en un intervalo de tiempo desde 60 hasta 210 min (Ecuación 13). La suma de la puntuación de la conjuntiva y el iris se expresaron mediante media ± SD.