Estudios genómicos y análisis de QTLs

Traslairrupcióndelasmodernastécnicasmolecularesqueculminaronconla secuenciacióndelgenomahumano,lainvestigacióngenéticasepropusoconocerel genoma de todas las especies de interés para la humanidad, entre ellas al melocotonero como especie representante del género Prunus. El objetivo de la genómicaesconocerelcontenido,evolución,origen,funcionamientoyestructuradel genomadelosseresvivos(MartinezͲGómezycol.,2011a).

LosprimerosestudiosgenómicosenPrunusteníanelobjetivodedesarrollar marcadoresmolecularesdistribuidosportodoelgenomadelasdistintasespeciesdel géneroydeestemodoestablecerunacaracterizaciónestructuraldelosgenomas. Ademássepretendíaestablecerunarelaciónentrelosmarcadoresmolecularesylas característicasagronómicaslocalizadasenunasecuenciadeDNAyconocerdeeste modoelcontenidoydistribucióndelgenoma.Esdecir,losmarcadoresmolecularesson unaherramientaparaseguirlapistaauntrozodeDNA.Enlosnoventaaparecieronlos primerosmarcadoresmolecularesparaelestudiodelgenoma,losRFLP(Restriction FragmentLengthPolymorphisms)quesecaracterizanporsercodiminantesymuy abundantesenelgenoma,perotenerquerealizardigestionesenzimáticasquehacían elprocesotediosojuntoconelabaratamientodelasecuenciaciónhanconvertidoa estatécnicaenobsoleta(Arúsycol.,2005).

LairrupcióndelaPCR(PolymeraseChainReaction)(Saikiycol.,1985)allanóel caminoparaeldesarrollodeRPDs(RandomAmplifiedPolymorphicDNAs)marcadores desegundageneraciónmásfácilesdeaplicarloqueaumentólasposibilidadesde caracterizaciónymapeodelgenoma.EstosmarcadoresamplificanunaregiondeDNA alazarnoconocidapreviamente,loque generamarcadores dominantesy poco

repetiblesloquelimitósuuso.

LosmarcadoresAFLP(AmplifiedRestrictionFragmentLengthPolymorphism) amplificanmediantePCRfragmentosderestricciónloquepermiteobtenerunvariado patróndebandasdistribuido por todoelgenoma,sinembargo setratadeun procedimientolentoloquelimitasuusodemanerarutinaria(Sorkhehycol.,2007).

Lasdificultadesenlosmarcadoresmencionadoshahechoqueactualmentela cartografíagenómicaserealicemediantemarcadoresSSR(SimpleSequenceRepeat) tambiénllamadosmicrosatelitesdebidoasualtopolimorfismo,adundanciaenlos genomasycaráctercodominante(Guptaycol.,1996;Arúsycol.,2005;MartínezͲ Gómezycol.,2011a).

EstosmétodosbasadosenPCRestánsiendosustituidospornuevosmarcadores desarrolladosapartirdelasecuenciacióndelDNA.Unodelosprincipalesproblemas parabuscarmarcadoresmolecularesbasadosenelconocimientodelasecuenciadelos genomasradicaensutamaño.InicialmenteelgenomadePrunusfueestimadoen280 Mbpmediantetécnicasdefluorescencia(ArumuganathanandEarle,1991;Bairdycol., 1994),estaestimaciónhasidoafinadamediantesecuenciacióna227Mbp(Sosinskiy col.,2009;Verdeycol.,2013).Tamañoconsideradopequeñoparaunvegetal(Jackson ycol.2011),yaqueseasemejamásalgenomade115MbpdeArabidopsisthalianaL. Heynh(2,4vecesmáspequeñoqueelgenomadePrunus).Enelotroextremodelreino vegetaltenemosAbiespieceaconungenomade20gigabasesyconunaestimaciónde 28.354genes,similaralnúmerodegenesdeArabidopsisthaliana,cuyogenomaes100 vecesmenor(Nystedtycol.,2013),esteresultadosserelacionanconacumulaciónde transposonesylafaltadeunmecanismoeficientedeeliminación.

LosestudiosgenómicossobrelaresistenciadelalbaricoqueroaPPVbasadosen la secuenciación y transformación genética apuntan a tres posibles mecanismos molecularesdecontroldelaresistencia:

a)Elmapeadocromosómicodelalbaricoqueroysucomparaciónconelgenoma de referencia de melocotón (““Peach genome V1.0””; www.rosaceae.org/peach/genome)(Verdeycol.,2013)sitúanlaresistenciaenlaparte superiordelgrupodeligamiento1(G1)yenunaregiónde10cM(2.100.000bp)entre

1y2CM(370.000a700.000bases)dondepodríahaberalrededorde250genesdelos cuales han identificado solamente 6 transcritos. Estos trabajos apuntan a una resistenciaconungenmayormonogénicaydominanteenalbaricoqueroconesta regióncomoprincipalresponsable(Zuriagaycol.,2013;Decrooqycol.,2014).

b) Estudios basados en la transformación de Arabidopsis thaliana han identificadocomoresponsablesdelaresistenciaadiferentesfactoresdeiniciaciónde latraduccióneneucariotaseIF4E,eIF4F,eIF4GyeIF4Eysusdiferentesisoformas repartidasportodoelgenoma.Laresistenciaseríapoligénica(másde3genes)y recesivaenmelocotónydominanteyoligogénicaenalbaricoqueroaunqueconungen mayor.Enestesentido,esconocidatambiénlaparticipacióndecomponentesdel complejodeiniciacióndelatraduccióneneucariotasenlaresistenciaapotyvirus, siendoenmásdel50%deloscasosresistenciarecesiva.Finalmente,losúltimos estudiosrealizados,revelanlagraninfluenciadel““background””genéticodelparental susceptibleenlaherenciadedicharesistencia(Decrooqycol.,2005;2014).

c)Finalmente,otrosestudiostransformandoelciruelo‘‘HoneySweet’’indican comoresponsabledelaresistenciauntransgenprovenientedelacápsidadelPPV (PPVͲCP)queinducesilenciamientogénicoybloquealadispersiónsistémicadelvirus (Scorzaycol.,1994).Estetransgenseheredacomoungenmendelianoconunalelo simpledominante.Estosautorestambiénhablandelaintroduccióndelaresistenciaen

Prunusmediante““genepyramiding””.

Laaplicacióndelosmarcadoresmolecularesjuntoconlasegregacióndelas característicasagronómicasdiolugaralaelaboracióndemapasdeligamientogenético (paracaracterísticascualitativas)yQTL(QuantitativeTraitLoci,paracaracterísticas cuantitativas).(Arúsycol.,2005;MartínezͲGómezycol.,2007;PeaceyNorelli,2009).

UnQTLesunaregióndelgenomaresponsibledelavariacióndecaracterque puedeserrelacionadaconlavariaciónalélicadeunmarcador(Asins,2002;Collardy col.,2005).Setratadeunaherramientautilcuandonoesposibleobtenerinformación específicasobreunosgenesolociespecíficos,perosisedisponedemarcadoresque permitensiguirlacomposiciónalélicarealizarsumapeo(Bertinycol.,2010;Olukoluy Kole,2012;Sorianoycol.,2008;2012).

ElanálisisdeQTLssiguesiendounadelosprocedimientosmásimportantesen los estudios preliminares para la identificación de características agronómicas en

Prunus.Estaherramientajuntoconlasecuenciacióndelgenomadereferenciadel

melocotoneroylosdatoscadavezmásabundantes desecuenciaciónmasivade transcriptomas establecen nuevas posibilidades para la aplicación de QTL en la identificacióndelosprocesosmolecularesresponsablesdemúltiplescaracterísticasde interes(MartínezͲGómezycol.,2012)yfacilitarlasestrategíasdehibridaciónvegetal (Dirlewangerycol.,2012;Boopathi,2013).Sinembargo,elusodelosQTLsenmejora vegetalestálimitadoporladispersióndelainformaciónenmuchaspublicacionesyla faltadeprocedimientosestandarizados.Conelfindesuperarestaslimitacionessehan desarrolladobasesdedatosdeQTLsdePrunusparafacilitarlacomparacióndela informaciónyunmetaͲanalisisdelainforamcióndistribuídaenlaspublicaciones(Huy col.,2012).LaBasedeDatosdelGenomadeRosaceae(GDR,www.rosaceae.org,Jungy col.,2008)eslabasededatosqueintegralainformacióngenética,genómicayde cruzamientos de las especies de esta familia. La base de datos ESTree (www.itb.cnr.it/estree/) está especializada en datos de la genómica funcional de

Prunus. Actualmente GDR contiene 885 QTLs relacionados con diferentes

característicasagronómicasenmultiplesespeciesdentrodelafamiliaRosaceaey700 QTLsenPrunus.

TodoslosmarcadoresrelacionadosconlaresistenciaaPPVquehansido estudiadosen distintasespecieshansidointegrado enocho pseudocromosomas formandounmapadereferenciagenéticodelgéneroPrunus.Respectoalosestudios deligamiento,sibienalprincipioselocalizóun““QuantitativeTraitLoci””(QTL)mayoren el grupo de ligamiento (G) G1 como responsable de la resistencia a PPV en albaricoquero; trabajos posteriores identificaron otras regiones implicadas en los grupos3y5,loqueapoyaríalastesisderesistenciapoligénica(Fighura1.9).

Losestudiosdesegregaciónrealizadosconnumerososmarcadoresmoleculares hanpermitidoidentificarvariosQTLsrelacionados conlaresistenciaa sharka en distintasespeciesdelgénero.ElQTLsmásrepresenttativoseencuentraenelgrupode ligamiento(LG)1yseconsideraresponsabledelaresistenciaaPPVenalbaricoquero (Vilanovaycol.,2003).OtrosQTLsaparecenenlosgrupos3y5(Lambertycol.,2007;

Lalliycol.,2008;Sicardycol.,2008;Sorianoycol.,2008).Sehanrealizadoestudios másespecíficosquerelacionanlosQTLsconlaresistenciaadiferentesaisladosdePPV enelLG1dealbaricoquerotipoDytresasociadosaaisladostipoM,yunQTLmenor enelLG5asociadoaresistenciaaltipoD(Pilarováycol.,2010)(Figura1.9).

Figura1.9.DistribucióndelosQTLs(entreparéntesisseindicanlosmarcadores

molecularesustilizados)relacionadosconlaresistenciaaPPVenlosgruposde

ligamientodelgenomadePrunusindicandolarefeneciadelestudio.Enverdese

indicanlosQTLsdescritosenP.davidianayenazulenalbaricoquero.

TodaestainformaciónsobrelaresistenciaaPPVenalbaricoqueroindicaquese tratadeuntipoderesistenciacuantitativayparcial(Sorianoycol.,2008).Ladiversidad genéticadelmaterialestudiadodificultalacaracterizacióndelasregionesresponsables delaresistencia.(Rubioycol.,2010).Lasaturacióndelosmapasdeligamientoscon másmarcadoresmolecularespermitiráreducireltamañodelosQTLresponsablesdela

resistenciaypoderconocerloslociresponsablesdeesascaracterísticas(Sicardycol., 2008).

Enmelocotonero(concretamenteenlaespeciepróximaP.davidiana)sehan descritohasta7QTLs(verfiguraadjuntadondeseindicalalocalizacióndelosQTLs ligadosalaresistenciaaPPVenalbaricoqueroyP.davidiana(Figura1.9)).