Estudios moleculares para la determinación del sexo en esturiones

Es evidente que una forma efectiva, rápida, relativamente poco traumática y precoz, sería poder disponer de un marcador de ADN que diferenciara sin ningún género de duda los individuos machos y hembras de esturiones.

La investigación en este apartado, se ha venido planteado desde tres enfoques diferentes:

1) mediante marcadores moleculares anónimos (RAPD, AFLP, etc.), 2) mediante la caracterización y análisis de genes candidatos para el determinismo sexual que hayan sido previamente estudiados en otras especies, 3) mediante técnicas de sustracción para intentar encontrar secuencias diferentes entre los genomas de machos y hembras.

1.3.4.1.

En general, los intentos de caracterizar algún marcador molecular asociado al sexo en los esturiones han resultado infructuosos. Así, Wuertz et al (2006) se centraron en la identificación de marcadores RAPDs, ISSR y AFLPs en cuatro especies de esturión (A. baerii, A. naccarii, A. gueldenstaedtii y A. ruthenus), no detectando en ninguno de los casos bandas específica para alguno de los sexos. Idéntico resultado, en estos casos, utilizando RAPDs, encontraron tanto McCormick et al. (2008) para la especie A. fulvescens y Keyvanshokooh et al. (2007) para la especie Huso huso. Recientemente, Yarmohammadi et al. (2011), tanto en A. persicus como en H. huso llevaron a cabo un análisis de AFLPs llegando a la conclusión que o bien los cromosomas sexuales en esturiones no están perfectamente diferenciados o bien las técnicas usadas hasta ahora no son lo suficientemente sensibles para llegar a diferenciarlos.

1.3.4.2.

En la búsqueda de genes clave en los mecanismos de diferenciación sexual de los esturiones, se ha sugerido la existencia de un gen maestro para la determinación sexual en algunas especies de esturiones (Eenennaam.,

1999; Hett y Ludwig., 2005). Siguiendo este enfoque, se han tratado de encontrar en el genoma de los esturiones, genes, implicados en estos procesos de determinación y diferenciación sexual, que ya han sido caracterizados en otras especies de peces.

De esta forma, y mediante el uso de cebadores degenerados diseñados en regiones conservadas entre especies de peces, se ha puesto de manifiesto la presencia de distintos genes implicados en estos mecanismos. Entre ellos, podemos destacar, los genes de la familia Sox (Sox2, Sox3, Sox4, Sox9, Sox11, Sox17, Sox19 y Sox21) en los genomas de las especies A. sturio (Hett y Ludwig., 2005; Hett et al., 2005) y A. fulvencens (McCormick et al., 2008). Estos genes están implicados en numerosos procesos del desarrollo y determinación sexual en vertebrados y codifican factores de transcripción relacionados con el Sry de mamíferos ligado al proceso de formación de testículos (Koopman et al., 1991; Wright et al., 1993; Russel et al., 1996).

Recientemente, (Berbejillo et al., 2012), utilizando también cebadores degenerados y diseñados en las regiones conservadas de los genes, se ha realizado un análisis de expresión diferencial de algunos de estos genes implicados en el desarrollo del testículo. Así, se ha comprobado la presencia en el genoma del esturión A. baerii, de los genes Dmrt1 y Sox9 (factores transcripción en células de Sertolli), Cyp17a1, y star, (factores de la células de Leydig en producción de androgenos), ar (receptor de andrógenos), igf1 (factor de crecimiento controlando el desarrollo testicular) y LH (hormona gonadotropínica). Estos autores han encontrando un claro dimorfismo sexual en la expresión de estos genes (sobre-expresados en testículos) en ejemplares juveniles de tres años.

Sin embargo, y utilizando esta misma técnica usando cebadores específicos, no se han podido amplificar estos genes en otras especies de esturiones, como A. naccarii (Lopez-Flores et al., 2005) o A. fulvencens (De Woody et al., 2010)

Otros genes, relacionados con el desarrollo gonadal, y que han sido analizados en esturión, en este caso en A. sinensis, son los denominados genes ZP (proteína de la zona pelúcida). Estos genes ZP codifican proteínas con un dominio ZP característico que contiene ocho cisteínas y un grupo

1. Introducción

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interno hidrofóbico muy conservado que juega un papel importante en su estructura secundaria y terciaria (Bork y Sander., 1992). Su papel fisiológico es el de formar parte de la matriz extracelular del folículo ovárico la denominada zona pelúcida. Se han caracterizado numerosas subfamilias de genes ZP pudiendo variar su número desde tres a cuatro en mamíferos hasta siete en peces habiéndose encontrado en el caso de algunas especies de peces tales como en O. latipes y D. rerio que en concreto el gen ZPC está duplicado (Goudet et al., 2008).

En la especie A sinensis, (Li et al., 2011) analizaron tres genes AsZP3.1 AsZP3.2 y AsZP.3.3. Estos dos últimos presentan una gran homología entre sí (alrededor del 82%) y sólo se expresan en gónadas pero muestran poca homología con AsZP3.1 que, por el contrario, presenta una gran amplitud de expresión tisular. Ninguno de los genes presenta expresión en estadios tempranos de desarrollo incluyendo etapas entre uno y dos años. Es a partir de los tres años cuando se observa su expresión en testículos de machos y en los ovarios de las hembras.

1.3.4.3.

En tercer tipo de abordaje en el estudio de la determinación sexual implica el uso de técnicas sustractivas para encontrar secuencias que son diferentes entre los genomas de machos y de hembras (y sin tener conocimientos previos de su secuencia o identidad). El sexo heterogamético contiene las mismas secuencias que el homogamético excepto aquellos loci determinantes del sexo. Esta técnica de hibridación sustractiva por supresión (HSS) se ha utilizado con éxito en peces tales como el salmón real (Oncorhynchus tshawytscha, Devlin et al., 1991), en la boga (Leporinus elongatus, Nakayama et al., 1994) y en la carpa común (Cyprinus carpio, Chen et al., 2010), siendo ampliamente utilizada para el estudio de diversos aspectos de la fisiología de peces (Larkin et al., 2003). Si bien se ha aplicado esta técnica utilizando ADN genómico total en varias especies de esturión, como A. transmontanus y A. fulvescens (Van Eenennaam., 1997 y McCormick et al., 2008, respectivamente), en ningún caso se han encontrado secuencias específicas de sexo. Adicionalmente, los análisis proteómicos realizados en A.

persicus, han puesto de manifiesto patrones proteicos similares en gónadas maduras de machos y hembras en esta especie (Keyvanshokood y Vazari., 2008; Keyvanshokood et al., 2009)

Sin embargo, la estrategia basada en la expresión diferencial, utilizando la sustracción, podrían dar algún resultado concluyente, y por tanto ser de mayor utilidad en esturiones, si partimos de sus transcriptomas (tanto de machos como de hembra) y no de su ADN genómico o proteínas, llevado a cabo hasta hoy en día y sin mucho éxito.