Estudios de la participación de las Panx en biología acrosomal

El acrosoma es una vesícula que participa en la movilización de Ca2+, siendo el principal reservorio de Ca2+ presente en el espermatozoide (Herrick et al., 2005; Costello et al., 2009). En los estudios de inmunofluorescencia indirecta, la localización subcelular de Panx3 sugiere una presencia acrosomal, la que es parcialmente confirmada en estudios en espermatozoides de hámster (Figuras 46 y 47). Estudios de Ishikawa et al., (2011), en osteoblastos, muestran que esta proteína puede actuar como un canal de Ca2+ en el retículo endoplasmático y el trabajo de Locovei et al., (2006), muestran que las Panx son canales de Ca2+ cuya apertura puede ser inducida por aumentos de Ca2+ citosólicos. Tanto P4 como ATP inducen un incremento del Ca2+ quees modulado por inhibidores de las Panx. Aparte, el aumento en la permeabilidad a colorantes inducido por P4 y ATP desde el espacio extracelular es completamente abolido en el modelo KO para Panx1, sin embargo, la RA se ve afectada parcialmente o no se ve afectada en los ratones KO cuando son estimulados con ATP o P4 respectivamente, pero si al incubar con inhibidores que no distinguen entre las 3 Panx. Esta información sugiere que podría existir una modulación de la actividad de las Panx acrosomales por Ca2+ citosólicos en el proceso de la RA. Para estudiar si Panx participan en la RA directamente modulando la función acrosomal, se utilizó el modelo de espermatozoide de ratón permeabilizado utilizando estreptolisina O (SLO). SLO es una proteína secretada por estreptococos que presenta actividad citolítica. SLO tiene la propiedad de interactuar con el colesterol de la membrana plasmática y formar agregados en la membrana plasmática que pueden generar poros estables. Estos poros generan una continuidad entre el espacio intracelular y el medio extracelular sin afectar la estructura de la membrana plasmática

(Johnson et al., 1999). En espermatozoides, esta estrategia ha sido utilizada para estudiar vías de transducción de señales que pueden estar relacionadas con receptores de superficie y estudiar la RA (Tomes et al., 2002). Para estudiar el rol de las Panx en la movilización de Ca2+ desde el acrosoma, se estimó la concentración óptima de SLO para permeabilizar espermatozoides sin afectar la permeabilidad del acrosoma, utilizando como inductor de la RA 10μM de CaCl2. Sólo espermatozoides permeabilizados en su membrana plasmática, pero con el acrosoma intacto, son capaces de reaccionar en esta condición (Tomes et al., 2002). Una vez calibrada la concentración de SLO, se preincubaron espermatozoides de ratón con 15μM de CBX y 1mM de PBD, y se indujo la RA con 10μM de CaCl2. La cuantificación de la RA se realizó con azul de coomassie El análisis de permeabilización mostró que la concentración de 1UI de SLO fue capaz de permeabilizar espermatozoides sin afectar la permeabilidad acrosomal dado que sólo espermatozoides permeabilizados reaccionaron en un medio HB- EGTA al adicionar 10μM de CaCl2 (Figura 38) (A Barra negra 1UI contra barra negra 0UI). La concentración de 2UI induce RA al inducir con o sin CaCl2, sugiriendo una permeabilización acrosomal previa por SLO. De acuerdo a este antecedente, se trabajó con la concentración de 1UI para la permeabilización de los espermatozoides (Figura 38) (A). Al preincubar espermatozoides capacitados y permeabilizados con SLO con CBX (45,54 ± 4,608%) y PBD (44,85 ± 3,42%) se redujo significativamente la RA inducida por 10μM de CaCl2 (57,41 ± 5,034%) (Figura 39) (A).

0 0,5 1 2 0 30 40 50 60 70 80 Estreptolisina O (UI) Veh 10M CaCl₂

***

*** *** ***

*

_*

Figura 38. Inhibidores de las Panx previenen la RA inducida por CaCl2 en espermatozoides

capacitados y permeabilizados de ratón.

A: Cuantificación de la RA en espermatozoides que se permeabilizaron con 3 concentraciones de SLO 0,5 UI, 1UI y 2UI e inducidos con 10μM CaCl2 (barras negras) o vehículo durante 15 min B:

Espermatozoides capacitados y permeabilizados con 1UI de SLO que fueron preincubados 15min con 15μM CBX, 1mM PBD o vehículo, y a los que se les indujo la reacción, con 10μM CaClo vehículo durante 15 min. El porcentaje de reacción acrosomal fue obtenido con la técnica de azul de coomassie. ANDEVA, Post-Test de Dunnett. ***p<0,001 *p<0,05.

A

DISCUSION

En esta tesis se estudió la participación de los canales de Panx en la capacitación y reacción del acrosoma en el espermatozoide de ratón. Los resultados muestran que las Panx (1, 2 y 3) se encuentran presentes en el espermatozoide, tanto en la cabeza como en la cola, regiones que, por la alta compartimentalización de la célula, estánrelacionadas con eventos específicos de la fisiología espermática. A pesar de que la localización de estas proteínas se estudió con inmunofluorescencia y microscopía confocal, una técnica que en su resolución está limitada para el estudio de ubicación exacta, permite sin embargo, presumir que estas se ubican en la cabeza, en la región acrosomal (Panx3); y en la pieza media de la cola (Panx1-3). La distinta compartimentalización de las Panx permitiría presumir una participación diferencial en la regulación de los cambios funcionales y bioquímicos de la cola, como adquisición de la motilidad progresiva en el epidídimo, la hiperactivación en capacitación, la regulación del pH intracelular, la liberación de colesterol o la hiperpolarización del potencial de membrana, así como en la cabeza donde ocurre la RA, eventos que serán discutidos más adelante.

En la cabeza, la región acrosomal contiene el acrosoma (Herrick et al., 2005; Costello et al.,

2009); y el segmento postacrosomal, la ENR (Ho y Suárez, 2003), mientras que la pieza media es la zona donde se ubican tanto las mitocondrias y como prolongaciones de la ENR (Ho y Suárez, 2003); siendo todas estas zonas, los principales depósitos de Ca2+ intracelular en este modelo de estudio (Ho y Suárez, 2003). La inmunolocalización de las 3 Panx está en relación con éstas zonas implicadas en la movilización de Ca2+, siendo Panx3 aquella con una marca muy limitada a lo que pareciera ser el acrosoma. Todos estos resultados, sumados a los estudios de motilidad en CASA y la utilización de espermatozoides permeabilizados, donde el componente de MP no participa, apuntan a que las Panx estarían implicadas en fenómenos de

movilización de iones en compartimientos celulares internos, los cuales regulan procesos claves como la adquisición de la motilidad progresiva y la RA, resultados que serán discutidos más adelante. Por otra parte, la fluorescencia observada en el estudio de la localización también sugiere la presencia en la MP, lo que relacionaría a estas proteínas con flujos de moléculas e iones desde y hacia el espacio extracelular.

Funcionalidad de los canales de Panx en capacitación y reacción acrosomal.

En el estudio de las Panx en esta tesis doctoral, se evidenció un incremento en la permeabilidad de la membrana plasmática a colorantes en la medida que aumenta la capacitación y que es inhibido al utilizar bloqueadores de las panx. Esto permite concluir que los canales formados por Panx son funcionales durante la capacitación. En este experimento, el colorante sólo fue adicionado 5 min al medio, y se cuantificó célula por célula la fluorescencia promedio del núcleo, permitiendo presumir que cambios relacionados con la capacitación alteran el estado de apertura de los canales haciéndolos más sensibles a la apertura o manteniéndolos en un estado de semi apertura. Esto podría deberse a cambios ocurridos en capacitación como la fosforilación (Visconti et al., 2011), ya que Panx posee sitios de consenso para la fosforilación por diferentes quinasas implicadas en capacitación (Barbe et al., 2006), s-nitrosilación (Visconti et al., 2011) o diferencias en el potencial de membrana. Es importante hacer una detención en el hecho que la estrategia experimental utilizada estudia la permeabilidad de Panx con un colorante extracelular, y que movimiento o cambios en la permeabilidad de compartimientos internos de la célula no pueden ser estudiados con esta estrategia. Es quizás por esta razón que al incubar espermatozoides de ratón deficiente de Panx1, la intensidad de fluorescencia del colorante se mantiene al nivel del

vehículo del animal silvestre, tal como ocurre en este último animal pero incubado en presencia de inhibidores de las Panx. Esto indicaría que la captación de colorantes extracelular es mediada por Panx1. Sin embargo, al incubar estos espermatozoides carentes de Panx1 con inductores de la RA como la P4, exhiben igual RA que espermatozoides controles del animal silvestre, indicando que no es necesario activar al canal de Panx1 para la capacitación, explicando que los animales Panx1-/- sean fértiles.

En la RA por otra parte, P4 y ATP indujeron un incremento en la permeabilidad de la membrana que se inhibe al utilizar los bloqueadores farmacológicos de las Panx o la delección genética de Panx1. En el caso de ambas moléculas, además, hubo una reducción de los espermatozoides que experimentaron la RA. Ambos resultados permiten concluir que las Panx son funcionales durante la RA y que su inhibición impide la RA. Por lo tanto, ya que por los resultados de IF, Western Blot e inhibición farmacológica y genética de la funcionalidad de las Panx, evaluada como permeabilidad a colorantes, se permite concluir que las Panx están presentes y son funcionales durante capacitación y RA. A continuación se discutirá su rol en las etapas involucradas en capacitación como la participación en RA de espermatozoides de ratón.

Participación de las Panx en la motilidad progresiva

Antes de ser eyaculados y durante el tránsito epididimario, los espermatozoides adquieren un tipo de motilidad conocido como motilidad progresiva (Ijiri et al., 2014). Este tipo de motilidad, cuyas características son una amplitud baja y simetría en el movimiento, está mediada por la proteína motora dineína que requiere de Ca2+ para su activación (Lesich et al.,

es aún desconocido. En esta tesis, cuando los espermatozoides de ratón son incubados en MNC, un medio que no promueve capacitación y en presencia de inhibidores de las Panx, exhiben una motilidad progresiva menor que controles incubados con el vehículo. Esto puede ser explicado por la participación de las Panx en la regulación del Ca2+ del espermatozoide. La motilidad progresiva depende de la movilización de Ca2+ sólo de depósitos internos (Gorus

et al., 1982), y las Panx están presentes en las zonas donde se ubican estos depósitos. En la literatura sabemos que por los experimentos de Vanden Abeele et al., (2006), utilizando una estrategia de inhibición de la SERCA con thapsigargina en otro modelo celular, y sobreexpresión de Panx1, se logró determinar que esta última proteína está implicada en la regulación de la fuga de Ca2+ desde el retículo endoplasmático hacia el citoplasma y que este mecanismo de liberación de Ca2+ desde el retículo también ha sido estudiado para Panx3 (Ishikawa et al., 2011). Esta evidencia, en conjunto con la independencia de Ca2+ extracelular en motilidad progresiva y la inmunolocalización de las Panx, sugiere que estas proteínas estarían implicadas en la mantención del nivel tónico de Ca2+ que se requiere para la actividad del flagelo. Sin embargo, se requieren más estudios, utilizando quizás Mag-Fura-2-AM una sonda de Ca2+ de alta afinidad que permite evaluar fuga de Ca2+ (Vanden Abeele et al., 2006), para demostrar si es este mecanismo de fuga de Ca2+ intracelular mediado por Panx, responsable de la disminución en el Ca2+ y la consecuente reducción en los parámetros de motilidad progresiva.

Canales de Panx y la hiperpolarización en capacitación.

En la medida que avanza la alcalinización del pH intracelular durante la capacitación, se activa el canal SLO3 que es sensible a pH y que induce flujo de K+ hacia el espacio extracelular

cambiando el Em del espermatozoide de -25,7 ± 6,6mV a -63,4 ± 17,1mV (Arnoult et al.,

1999). Este mecanismo es esencial y suficiente para iniciar la capacitación. Cuando espermatozoides de ratón no capacitados son incubados con inhibidores de las Panx, El Em de

espermatozoides no se vió modificado significativamente. Sin embargo, no fue posible observar el potencial más positivo presente en muestras no capacitadas registrado por publicaciones anteriores (-25mV) (Arnoult et al., 1999; Chávez et al., 2014). Esto puede deberse fundamentalmente a diferencias en el manejo de los animales (cepas diferentes de ratón), la gran variabilidad de las muestras y diferencias en los MNC. Sin embargo, al incubar durante 1h en MC, los espermatozoides muestran un potencial de membrana de -54,79mV ± 4,751mV que es más positivo cuando se registró en células incubadas en presencia de CBX o PBD, -46,67mV ± 4,234mV y -46,7mV ± 1,267mV respectivamente. Concluyendo que al inhibir las Panx, los espermatozoides capacitados se depolarizan levemente. Esto podría deberse a una alteración en el flujo de iones que no favorezcan la gradiente necesaria tanto para la alcalinización del pH, suponiendo que las Panx podrían estar implicadas en salida de H+ o entrada de HCO3-, dado que la gradiente de H+ y la presencia de HCO3- en el medio de cultivo llevan a la activación de transportadores de H+ y HCO3- esenciales para la capacitación (Chávez et al., 2014). Entre ellos al sNHE, al transportador Na+-Cl−/HCO3− y el transportador Na+/HCO3− que utilizando la gradiente de Na+ a favor en la célula, llevarán a la alcalinización del pH intracelular. Por lo tanto si en cualquiera de estas etapas hubiera participación de las Panx, o en la salida de K+, ocurriría una consecuente menor hiperpolarización fisiológica. Sin embargo para demostrar cualquiera de estas hipótesis se requiere más experimentos.

Hiperactivación espermática

En los espermatozoides se activa el CatSper, un canal catiónico que moviliza Ca2+, luego de la hiperpolarización y alcalinización del pH. Cuando CatSper es activado, el patrón de nado de espermatozoides cambia de uno progresivo a uno hiperactivado, sin relacionarse con la habilidad del HCO3- para inducir la activación de la motilidad ni la cascada de fosforilación en proteínas en capacitación (Carlson et al., 2003). De hecho, los espermatozoides del ratón deficientes para una de las subunidades del CatSper sólo son infértiles debido a que son incapaces de mostrar motilidad hiperactivada y ascender a través del oviducto (Ho et al.,

2009). A diferencia de lo que ocurre con los espermatozoides CatSper1-/-, la modulación farmacológica de las Panx no afecta la hiperactivación espermática, ni tampoco afecta el porcentaje de espermatozoides que muestran hiperactivación. Esto es de gran importancia ya que el CatSper es altamente promiscuo en su farmacología, lo que lo hace blanco de múltiples drogas activadoras o inhibidoras (Barratt y Publicover, 2012), pudiendo ser sensible a CBX o PBD, sin embargo la huella farmacológica de inhibidores del CatSper muestran una reducción en la hiperactivación del espermatozoide de ratón, afectando el porcentaje de espermatozoides que se hiperactivan, evento que no se ve alterado al incubar con CBX ni PBD. Esto permite sugerir que en los eventos relacionados con la activación de la hiperactivación, las panx no participan o bien su participación se ve compensada por la activación de otros sistemas que movilizan iones o tienen igual función.

Pannexinas participan en la liberación de colesterol en la cola del espermatozoide.

Un evento de la capacitación que ocurre es la liberación de colesterol (Davis, 1976). Es tan relevante la disminución en el contenido de esteroles en la membrana, que la hiperpolarización

no ocurre si los espermatozoides son capacitados en un medio que contiene bajas concentraciones de BSA (Arnoult et al., 1999), lo que está indicando que todos estos mecanismos antes mencionados requieren de la liberación de colesterol. Es bien sabido que la interacción entre lípidos y proteínas puede modular la actividad de canales, esto podría ser una explicación al incremento de la permeabilidad a colorantes durante la capacitación. Otros estudios en otros mamíferos muestran que la remoción del colesterol mediado por la albúmina requiere de una modulación dada por el HCO3- que desestabilizaría inicialmente a las membranas biológicas (Flesch et al., 2001). Esta última información estaría en concordancia con la teoría de la modulación del influjo de HCO3- durante los eventos de alcalinización del pH e inicio de la hiperpolarización, así como con un aumento en la permeabilidad que no se relaciona con el Ca2+ involucrado en hiperactivación en capacitación, explicando que la incubación con CBX y PBD produzca una retención del colesterol en la cola del espermatozoide. De hecho, hay publicaciones que indican que Panx1 actua como un canal aniónico (Ma et al., 2012, Romanov et al., 2012), que podrían avalar esta hipótesis. En la cabeza del espermatozoide, en tanto, existe un transportador activo de colesterol ABCA17 (Morales et al., 2012) que media la liberación del colesterol a las moléculas aceptoras de colesterol, que tendría relación con la ausencia de inhibición de CBX y PBD en esta región. Aunque no ha sido mencionado, uno de los beneficios de utilizar la microscopía confocal en el estudio del colesterol marcado con filipina es la posibilidad de discriminar en diferentes regiones del espermatozoide. Hasta ahora, la mayoría de los estudios que utilizan esta técnica en espermatozoides de ratón utilizan la citometría de flujo para determinar cuantitativamente la reducción del colesterol (Visconti et al., 1999; Takeo et al., 2008) sin determinar

variaciones en el contenido entre cola o cabeza, por lo que el uso de esta estrategia permitiría estudiar diferentes regulaciones según compartimientos.

Rol de los canales de Panx en la reacción acrosomal.

Como se discutió con anterioridad, la RA se correlaciona con un incremento en la permeabilidad de la membrana plasmática a colorantes desde el espacio extracelular que se ve inhibido completamente con inhibidores farmacológicos de las Panx o la delección genética de Panx1 y que no ocurre al incubar con vehículo. Esto nos sugiere que luego de la incubación con P4 o ATP existe un mecanismo que lleva a la apertura de Panx1 en la membrana plasmática de espermatozoides. Además, la inhibición farmacológica previene la RA inducida por ATP, P4 y ZP.

La real contribución de Panx1 en la RA es contradictoria, porque aún cuando existe un fenómeno de incremento en la permeabilidad a colorantes, al incubar espermatozoides de ratones Panx1-/- con P4 o ATP, la RA ocurre, aunque en el caso de la RA inducida por ATP existe una reducción del 33% con respecto a espermatozoides de animales silvestres, a pesar de una reducción completa al utilizar inhibidores que no discriminan entre las 3 Panx. Esto nos permite sugerir que tanto Panx2 como Panx3 poseen un efecto importante en la RA y se requiere de su activación para la RA inducida por ambas moléculas y ZP en espermatozodides de ratón. De todas maneras, el hecho de que Panx1 aumente la permeabilidad de la membrana en respuesta a P4 y ATP pero su participación en la RA no sea fundamental podría corresponderse con una teoría de que Panx1, por si sola, no modula eventos importantes en el espermatozoide pudiendo estar relacionada con otros fenómenos involucrados en la RA como el aumento del pH intracelular y el swelling acrosomal (Darszon et al. 2011) o su

participación, al ser eliminada genéticamente, compensada por sobreexpresión de otras proteínas con función similar. Sin embargo, no se puede descartar que la reducción observada en el caso del ATP podría deberse a la propiedad de esta proteína de acoplarse a la activación de P2X7 (Iglesias et al., 2008), el que está presente en espermatozoides de ratón y cuya inhibición, coincidentemente, bloquea un 30% la RA.

Por otra parte, la localización subcelular de Panx3 sugiere una presencia acrosomal, que puede ser indirectamente comprobado utilizando el modelo de espermatozoides de hámster, cuyo mecanismo de fusión de vesículas sólo posee un punto único de fusión y que genera un fragmento único de membrana que incluye la membrana acrosomal externa y la membrana plasmática (Franklin et al., 1970). En este modelo, al ocurrir la RA, los espermatozoides de hámster pierden la marca fluorescente para Panx3 y esta persiste en el borde cóncavo de la vesícula liberada. Esto es importante, porque el acrosoma es el principal depósito de Ca2+ del espermatozoide (Herrick et al., 2005; Costello et al., 2009) y la liberación de Ca2+ desde esta vesícula es un evento necesario para la RA (Darszon et al., 2011).

Como conclusión, durante la RA existe un incremento de la permeabilidad a colorantes