ETAPA EXPERIMENTAL Selección de participantes

Se reclutaron 5 voluntarios que cumplían los criterios de inclusión para la investigación. No se realizó ningún tipo de muestreo. Todos eran varones saludables, no fumadores ni alcohólicos, con edades comprendidas entre 18 y 45 años y no estaban haciendo uso de medicamentos ansiolíticos, antidepresivos ni ningún otro tipo.

Aspectos Éticos

Todos los participantes fueron informados previamente sobre los objetivos del trabajo, se aclararon todas las dudas existentes y luego se les entregó el término de consentimiento (Anexo 1) para que sea firmado en forma libre. La realización de este procedimiento siguió las recomendaciones de la resolución 466/2012 de la Comisión Nacional de Ética en Pesquisa con Seres Humanos (CONEP) de Brasil y fue aprobado por el Comité de Ética en Pesquisa con Seres Humanos de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de Ribeirão Preto - FCFRP-USP (CEP/FCFRP nº 331).

Purificación de neutrófilos humanos

Se tomaron muestras de sangre total de los 5 participantes; con cada muestra se trabajó de acuerdo al procedimiento establecido (Anexo 2). De cada sujeto, se extrajeron 20 ml de sangre por punción venosa en la región de la fosa cubital, utilizando material estéril y descartable.

Los neutrófilos fueron purificados por el método de la gelatina, descrito por Lucissano y Mantovani (60) y con algunas modificaciones de Kabeya (61,62). La sangre

31 colectada por punción venosa con sistema de vacío fue diluida volumen a volumen en solución Alséver pH 6.1, utilizada como anticoagulante, y posteriormente fue centrifugada a 755 x g por 10 minutos a 22ºC (Ultracentrifugadora Eppendorf 5810 R, Hamburg, Alemana). Después se removió el plasma y la camada de células mononucleares por aspiración con pipeta; el sedimento fue diluido en solución de gelatina a 2.5%, preparada en NaCl 0.15 mol/L e incubado en baño maría a 37ºC por 15 minutos. El sobrenadante rico en neutrófilos fue diluido en igual volumen de NaCl 0.15mol/L y centrifugado a 440 x g por 10 minutos a 22ºC. Para lisar los eritrocitos remanentes, el sedimento fue suspendido en solución de NH4Cl 0.83% pH 7.2,

incubado por 5 minutos a 37ºC y entonces centrifugado a 480 x g por 10 minutos a 22ºC. El sedimento fue lavado con NaCl 0.15mol/L y suspendido en 1mL de Solución Hanks conteniendo 0.1% de gelatina, obteniendo así un concentrado de neutrófilos.

Posteriormente se procedió al cálculo aproximado del número total de neutrófilos, para lo cual se coloreó 10µL del concentrado de neutrófilos con 990mL de Líquido de Turk y se contabilizó en una cámara Neubauer. De acuerdo al número de células calculado, el concentrado de neutrófilos fue diluido con Solución Hanks conteniendo 0.1% de gelatina hasta obtener una concentración de 4x106 células/mL, que es la cantidad patrón con la que se trabajó en los posteriores procedimientos.

La viabilidad celular fue evaluada por el ensayo de colorante Azul de Tripan. Las preparaciones de neutrófilos obtenidas por el procedimiento de purificación presentaron cerca del 90% de pureza y 95% de viabilidad.

Preparación del estímulo forbol-12-miristato-13-acetato (PMA)

El PMA se usó para estimular la producción de EROs en los neutrófilos. El PMA fue disuelto en DMSO en concentración de 10-2 mol/L y conservado a -70 ºC. En el momento del uso, alícuotas de este estímulo fueron diluidas en solución Hanks pH 7.2, hasta la concentración final de 10-7_mol/L.

Preparación de Luminol

Se utilizó Luminol para la amplificación de la respuesta de medida de quimioluminiscencia, por ello se preparó Luminol 100umol/L con Solución Hanks.

32 Preparación de las soluciones con las drogas en estudio

Se usaron las siguientes drogas:

 Nicotina: agonista colinérgico que actúa sobre receptores colinérgicos tipo nicotínico.

 Salbutamol: agonista adrenérgico que actúa sobre receptores adrenérgicos tipo Beta 2.

 Clonidina: agonista adrenérgico que actúa sobre receptores adrenérgicos tipo Alfa 2.

En micro balanza se pesó cantidad suficiente para preparar soluciones acuosas de las drogas a 4 concentraciones (10-2_,10-3_{, 10}-4 _{y 10}-5 _{mol/L), las cuales se determinaron}

en las pruebas piloto. Se utilizó Solución Hanks como solvente.

Evaluación del estallido respiratorio de neutrófilos humanos

Se procesó cada muestra de neutrófilos aislados para medir la producción de Especies Reactivas de Oxígeno (EROs) mediante el método de quimioluminiscencia; la metodología fue descrita por Andrade et al, 2013 (63). En placas de 96 pozos se adicionó: 50µL del preparado de neutrófilos 4 x 106 células/m, 30µL de Luminol 100 umol/L y 100L de solución Hanks; en seguida fue adicionado el estímulo 20L de PMA (10-2 mol/L) hasta llegar a la concentración de 10-7 mol/L e inmediatamente se midió la quimioluminiscencia (QLlumPMN) en c.p.s (fotones contados por segundo) durante 15 minutos a 37°C en luminómetro de microplacas (modelo LB 960 Centro, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemana).

A partir de los perfiles cinéticos de QLlumPMN en función del tiempo, fueron calculados los valores de área integrada (área sobre la curva) de 0 a 15 minutos. Estos valores representan la cantidad total de EROs producidos en este intervalo de tiempo (64) y constituyeron nuestro “Control” para las comparaciones posteriores. Cada grupo experimental tuvo su propio control (Anexo 2). Además se realizaron experimentos “Blanco”; para ello se procesaron muestras sin PMA, siendo reemplazado por 20µL de Solución Hanks, para evaluar la producción espontánea de EROs en los neutrófilos. Cada grupo experimental tuvo su propio blanco (Anexo 2).

33 Determinación del efecto de agonistas adrenérgicos y colinérgicos sobre el estallido respiratorio de neutrófilos humanos.

Los grupos experimentales estuvieron formados por muestras de neutrófilos purificados expuestos a las soluciones acuosas de drogas preparadas anteriormente para luego medir la producción de EROs por quimioluminiscencia. En placas de 96 pozos se adicionó: 50µL del preparado de neutrófilos 4 x 106 células/m, 30µL de Luminol 100 umol/L y 100L de la solución acuosa de la droga correspondiente; en seguida fue adicionado el estímulo 20L de PMA (10-2 _{mol/L) hasta llegar a la}

concentración de 10-7 _{mol/L e inmediatamente se midió la quimioluminiscencia}

(QLlumPMN) en c.p.s (fotones contados por segundo) durante 15 minutos a 37°C en luminómetro de microplacas. Se realizaron 3 repeticiones con cada concentración de droga en cada participante haciendo un total de 15 repeticiones por cada concentración de Nicotina, Salbutamol y Clonidina.

Una vez más a partir de los perfiles cinéticos de QLlumPMN en función del tiempo, se calcularon los valores de área integrada (área sobre la curva) de 0 a 15 minutos. Estos valores se compararon con los controles correspondientes para ver si hubo algún cambio en la cantidad producida de EROs promovida por las drogas analizadas y se determinó el porcentaje de inhibición o estimulación, según sea el caso, en relación a los respectivos controles, siguiéndose la siguiente fórmula:

% I = 100 - [(AS/AC) x 100] % E = [(AS/AC) x 100] – 100 Donde:

% I: porcentaje de inibición de QLlumPMN en relación al control % E: porcentaje de estimulación de QLlumPMN en relación al control AS: área integrada de QLlumPMN _{de cada concentración evaluada}

AC: área integrada de QLlumPMN del control