Etapas en la formación de biopelícula

El proceso de la formación de biopelículas es dinámico y complejo e involucra esencialmente una transición de un estado planctónico a uno sésil (sedentario). Este proceso involucra una variedad de interacciones físicas y metabólicas necesarias para la adhesión, crecimiento, supervivencia y un subsecuente desprendimiento de las células. Este es un comportamiento complejo que conlleva a cambios en las células que conforman la biopelícula, impartiéndoles propiedades que las distinguen de las células en estado planctónico (Watnick & Kolter, 2000). Las bases genéticas de la formación de biopelículas se han investigado en varios microorganismos Gram negativos y Gram positivos e indican que es un proceso altamente regulado que involucrada mecanismos variados dependiendo del microorganismo y de las condiciones ambientales. Las etapas de desarrollo parecen estar conservadas entre una notable variedad de procariotas y típicamente implican la fijación de las bacterias planctónicas a una superficie, la replicación, la adhesión célula-célula para formar microcolonias, la maduración, y el desprendimiento. Debido a que estos pasos se pueden superponer, la formación de biopelículas se puede dividir en tres etapas principales: (1) de fijación a una superficie (2) la proliferación y la formación de la estructura de la biopelícula madura y (3) desprendimiento o dispersión de la células (Figura 1) (Davey & O’toole, 2000; Joo & Otto, 2012; Martínez & Vadyvaloo, 2014).

2.3.2.1 Etapa 1: Fijación a una superficie

En general, las características bacterianas que determinan el grado de unión a las diferentes superficies tienen una naturaleza fisicoquímica. La más notable de éstas es la hidrofobicidad, que se determina por la composición global de la superficie bacteriana, y es inherente a cada especie bacteriana. En este punto, las células bacterianas por lo general presentan una tasa de crecimiento logarítmico. La etapa de adhesión se puede dividir en dos:

- Acondicionamiento o adhesión inicial

Algunos autores denominan esta etapa como la biopelícula en monocapa, definida como una sola capa de células adheridas a la superficie (Donlan & Costerton,

Etapa 1. Fijación a una superficie (Acondicionamiento – Adhesión inicial). Etapa 2: Proliferación y la formación de la estructura de la biopelícula madura. Etapa 3: Desprendimiento o dispersión de la biopelícula 

2002b; Karatan & Watnick, 2009). Las bacterias entran en contacto con el medio, haciendo que la bacteria se ubique en la interfase agua/superficie para cambiar las propiedades químicas y físicas de la misma y mejorar las posibilidades de fijación bacteriana. Factores externos pueden afectar la adhesión bacteriana, por un lado factores físicos y químicos de la superficie, como la rugosidad, por otro lado los factores del medio líquido en el que se desarrolla, como la velocidad del flujo y la composición química del mismo (Rogers & Hudson, 2013). Se ha descrito que en esta etapa son importantes las adhesinas preformadas de los flagelos y las fimbrias (pili), entre las cuales se mencionan las fimbrias tipo I, IV y los curli. La motilidad parece que ayuda a la bacteria a alcanzar la superficie y contrarrestar las repulsiones hidrofóbicas. Sin embargo, aunque la motilidad ayuda al proceso, no parece ser un requisito esencial, pues muchas bacterias inmóviles son capaces de formar biopelícula. Las adhesinas sintetizadas bajo ciertas condiciones son secretadas por el microorganismo; éstas son adhesinas específicas de unión que les permiten en algunos casos anclarse o internalizarse en las células eucariotas del hospedero, siendo propias de cada microorganismo o especie bacteriana (Karatan & Watnick, 2009; Rogers & Hudson, 2013).

- Adherencia bacteriana

Ocurren interacciones célula-célula y célula-superficie para comenzar el proceso de colonización, también llamada biopelícula de multicapa. Esta unión está mediada por apéndices que ayudan a superar una barrera de repulsión electrostática. El proceso involucra nuevamente componentes específicos del flagelo y fimbrias, como se ha descrito en bacterias Gram negativas como P. aeruginosa, y E. coli, entre otros. En Gram positivos se ha descrito la adhesión mediante polisacáridos extracelulares, como sucede en Staphylococcus epidermidis (Del Pozo et al., 2007; Karatan & Watnick, 2009; Watnick & Kolter, 2000). Las bacterias que encuentran la superficie conveniente, forman con ella una unión reversible, dependiendo de las cargas iónicas de la bacteria, son atracciones de tipo electrostático o hidrófobo y fuerzas de Van der Walls, sin unión

química, pero igual favorecen la unión a proteínas, glicoproteínas, o los receptores de polisacáridos sobre la superficie del huésped (tejidos) o de los implantes médicos (prótesis valvulares, ortopédicas, etc.). Ya que éstos son enlaces o fuerzas débiles se atribuye el hecho de que puede ser una “adhesión reversible” (Dunne, 2002; Sanclement et al., 2005).

Se habla de “adhesión irreversible” cuando el anclaje de apéndices bacterianos y la producción de exopolisacárido consolida el proceso de adhesión y forma un complejo con el material superficial y receptores, mediante uniones específicas y fuertes. Al terminar esta fase las biopelículas son difíciles de erradicar de cualquier superficie, como tejidos, acero inoxidable o material médico, y mientras más tiempo tenga de formado será más difícil su erradicación. Por esto se habla de relación espacio - temporal en la formación de la biopelícula (Dunne, 2002; Joo & Otto, 2012).

En biopelículas in vivo, como en tejidos o dispositivos médicos en el cuerpo humano, la adhesión se rige principalmente por la interacción de las bacterias con proteínas de la matriz de células humanas, que cubren eficazmente los dispositivos pronto después de la inserción. En Staphylococcus sp. se reconocen ya ciertas moléculas denominadas MSCRAMM (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules), que son una clase de adhesinas bacterianas que median la colonización del hospedero mediante el reconocimiento de moléculas de la matriz de las células humanas, tales como unión a fibrinógeno y fibronectina (Joo & Otto, 2012).

2.3.2.2 Etapa 2: Proliferación y la formación de la estructura de la biopelícula madura

Esta etapa incluye el desarrollo temprano de la arquitectura de la biopelícula. Las bacterias previamente adheridas comienzan a dividirse y las células se extienden alrededor del sitio de unión, formando una microcolonia, que son estructuras

similares a setas (mushrooms). Una vez establecida una microcolonia, los agregados celulares generan estructuras tridimensionales complejas y producen una matriz extracelular, la cual consiste predominantemente de un polisacárido extracelular pero que puede contener además otros componentes minoritarios como proteínas, ácidos grasos y ADN extracelular, entre otros. Estos EPS también varían entre bacterias y es así como se conoce el polisacárido adhesina intercelular (PIA), también llamado poli-N-acetil glucosamina [PNAG] en S. aureus y S. epidermidis. También se ha puesto de manifiesto que una misma bacteria, dependiendo de las condiciones ambientales en las que se encuentre, puede producir distintos EPS como componentes de la matriz de la biopelícula. En P. aeruginosa se han descrito tres EPS: el polisacárido Pel, rico en glucosa, Psl rico en manosa y alginato, un polisacárido compuesto de ácido glucorónico y ácido manurónico. E. coli sintetiza principalmente PGA, ácido colánico, y celulosa. La celulosa es un polímero comúnmente producido por agentes patógenos entéricos, incluyendo Salmonella, Citrobacter, Enterobacter y Shigella, donde ha sido fuertemente asociada con la capacidad de formar una biopelícula rígida. En biopelículas también se conoce la producción de otros polisacáridos como la glucosa y la galactosa, entre otros (Da Re & Ghigo, 2006; Joo & Otto, 2012; López, Vlamakis, & Kolter, 2010; Solano et al., 2002; Sutherland, 2001; Zogaj, Nimtz, Rohde, Bokranz, & Römling, 2001).

Las bacterias adheridas y en división fabrican constantemente los EPS que excretan al exterior para mantener unidas las células, entre ellas y con la superficie, proceso que constituye la maduración de la arquitectura de la biopelícula. Dentro del EPS de las biopelículas se pueden encontrar diferentes fenotipos bacterianos dependiendo del nicho en el cual se encuentren las células, generado por los canales o espacios intercelulares que permiten el paso de nutrientes y oxígeno a la biopelícula (Davey & O’toole, 2000; Rogers & Hudson, 2013).

2.3.2.3 Etapa 3: Desprendimiento o dispersión de la biopelícula Una vez la biopelícula ha alcanzado madurez algunas bacterias se liberan para colonizar otras superficies en la fase de separación o desprendimiento, cerrando así el proceso de desarrollo de la biopelícula. Muy a menudo el estado nutricional del medio ambiente determina el comportamiento de las bacterias. Por tanto, la dispersión de la biopelícula se puede dar por la depleción o aumento de nutrientes en el medio o al interior de la biopelícula (Donlan & Costerton, 2002a; López et al., 2010; Martínez & Vadyvaloo, 2014). Otros factores que influyen en la dispersión de biopelículas incluyen la presencia de oxígeno, algunos subproductos de metabolismo anaeróbico, la señalización tipo quórum sensing y los niveles del segundo mensajero c-di-GMP. También se mencionan algunas enzimas que degradan la matriz extracelular de la biopelícula, la liberación del EPS y proteínas de unión a superficie, la motilidad, la producción de surfactantes y la lisis celular, entre otros.

La liberación final de las bacterias de la biopelícula es el proceso que menos se conoce y los detalles exactos de la dispersión no se han aclarado. Sin embargo,

se ha descrito que la variación de fase en S. aureus puede producir cepas deficientes en producción de expolisacárido en etapa final o biopelícula madura y por tanto disminuye o finaliza la estructura multicelular. Igualmente en Actinobacillus actinomicetecomitans se ha descrito una enzima denominada “dispersina” que degrada de forma específica el EPS de la matriz de la biopelícula, permitiendo de esta forma la liberación de bacterias que vuelven a su estado planctonico (López et al., 2010; Post et al., 2004).