• Extracción de ADN
El ADN es la molécula que contiene el diseño de todas las formas de vida de la Tierra. Las instrucciones que dirigen la vida de todas las células de un organismo y confi eren a cada una sus caracterís- ticas especiales están en esta molécula. El ADN también permite a los organismos o a las células de un organismo transmitir la información con precisión de una generación a la siguiente. La extracción del ADN consiste en la separación de este de los demás componentes de la célula o del ambiente del cual se tomó la muestra. Esta incluye una lisis rotura de la pared celular para liberar el ADN del interior celular. Posteriormente se realiza la eliminación de contaminantes como proteínas y fenoles (Figura 18). Finalmente para obtener el ADN se realiza una precipitación y limpieza del mismo, con etanol y ARNasa, una enzima que elimina otro tipo de ácido nucleico llamado ARN.
• Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Una región particular en el ADN es multiplicada varias veces a través de un procedimiento conocido como reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). Para esto es necesa- rio contar con las secuencias o marcadores en los extremos de la zona de interés. Estos marcadores hacen referencia a cualquier diferencia existente en la secuencia de ADN entre individuos. La PCR consiste en una serie de ciclos que involucran cambios de temperatura con lo cual la doble cadena de ADN es reducida a cadenas sencillas, luego es unida a marcadores específi cos que permiten una extensión de la cadena de ADN para fi nalmente obtener un fragmento multiplicado. Este procedimiento se realiza en un equipo llamado termociclador (Figura 19)
Figura 19. Termociclador empleado en el procedimiento de amplifi cación del ADN por PCR.
• Visualización de amplifi cación
Los fragmentos obtenidos en la PCR son visualizados a través de una electroforesis, la cual permite separar las regiones multi- plicadas de acuerdo al tamaño de cada una (Figura 20). Para tal fi n se emplean geles con agujeros a través de los cuales pasan los fragmentos o regiones multiplicadas. Los fragmentos de menor tamaño pasan primero mientras los de mayor tamaño migran a menor velocidad. Cada una de estas fracciones es visualizada como bandas en el gel.
Figura 20. Cámara de electroforesis para la visualización de los productos de la PCR
• Lectura de bandas, determinación de homocigosis
Las bandas obtenidas por cada gel se comparan para establecer si existen diferencias entre los individuos que ellas representan (Figura 21).Figura 21. Gel de poliacrilamida con dos marcadores polimórfi cos. Las letras representan cada uno de los ecotipos
amplifi cados: C, Colombia; K, Kenia y P, Perú. En el primer carril aparece un marcador de peso para la identifi cación del
peso de las bandas.
El análisis de las bandas de ADN es muy útil, primero, para confi r- mar que las plantas se originan de los granos de polen inmaduro y segundo, para determinar el estado homocigoto de las plantas fértiles obtenidas. Para esos propósitos se usaron los marcadores 77, 126 y 146. El marcador 77 es polimórfi co al amplifi car una banda única para el ecotipo Kenia. Cuando se emplea este marcador en la amplifi cación de las plantas donantes y de las plantas obtenidas in vitro, se observa un patrón de bandas similar al ecotipo Colombia. En cuanto a homocigosis de las plantas in vitro se observan dos bandas, tanto para las plantas con 24 cromosomas como para las plantas con 48 cromosomas. Los marcadores 126 y 146 son monomórfi cos en los tres ecotipos, es decir, con este marcador no se pueden diferenciar los genotipos. Sin embargo, presentan dos bandas claramente diferenciadas por lo cual son útiles para determinar homocigosis al compararse el material donante y el material regenerado. Lo anterior se deduce del supuesto que si el material donante presenta dos bandas indicaría heterocigosis, mientras que el regenerado que se espera sea homocigoto solo presentaría una banda. Pese a la diferencia en el número cromosó- mico del material in vitro, se observó un patrón de bandeo similar
al material donante. Lo cual sugiere que para este experimento los marcadores moleculares no estarían determinando la diferencias entre donantes y plantas in vitro (Figura 22).
Figura 22. Amplifi cación con el marcador 77 en el material control, donante y regenerado. Los códigos arriba hacen referencia al nombre del material. Las letras P, parental; H, Li, A11, A9 y P2 son materiales regenerados. De los materiales EE3
y LE1 se regeneraron 2 plantas, y del material B4 una planta.
Realización de cruzamientos
El gran valor de las líneas puras en especies alógama o prevalen- temente alógama, es su utilización en la producción de cruces o híbridos con fi nes comerciales. Con la obtención de líneas puras por medio del cultivo de anteras, en uchuva se abren las puertas para obtener híbridos comerciales para apoyar la sostenibilidad y mejoramiento del cultivo en Colombia. Uno de los resultados del proyecto fue la obtención de cruces entre varias líneas puras obtenidas en el laboratorio con el fi n de evaluar la producción de semilla y posteriormente el comportamiento de estos híbridos a nivel de uniformidad de las plantas y del fruto. En la tabla 4 se presentan los cruces realizados utilizando plantas las fértiles ob- tenidas por cultivo de anteras. Los frutos obtenidos se le hicieron una caracterización por tamaño y número de semillas formadas. Tabla 4. Cruzamientos realizados utilizando las plantas fértiles obtenidas por cultivo de anteras.
Cr uc e R eg istr o fo to gr áfi c o Num er o de fr ut os co le cta do s D iám etr o (cm) º B rix Num er o de semill as/ fr ut o To tal semill as Pes o pr om edi o/ fr ut o ( gr ) Lo ng itu din al Tr ans ver sal 1 X 1 6 1.8 1.5 1.6 1.8 1.6 1.6 15.8 14.4 17.3 70 70 150 150 123 113 121 797 2.06 2.06 2.03 2.03 2.60 2.35 2.36 1 X 2 2 0.9 0.8 3 So lo en un o d e l os fr ut os 3 0.23
1 X 3 2 1.6 1.7 13.4 15.3 231 248 479 3.91 2.98 1 X 4 4 1.4 1.4 11.6 13.8 78 70 70 218 1.67 1.04 1.02 2 X 1 ---- --- ---
2 X 2 1 30 30 1.63 3 X 1 1 16.2 50 44 94 1.40 1.40 3 X 2
3 X3 2 11.2 13.5 105 105 178 2.29 2.3 2.06 3 X 4 1.55 1.45 12.4 17.1 121 126 2.03 4 X 1 14.3 10.0 136 137 2.52 2.08
4 X 2 1.05 1.1 20 1.0 4 X 3 1 2 2 11.7 200 200 150 550 3.31 3.72 3.74 4 X 4 2 1.5 1.5 14.5 14.6 12.2 14.4 139 140 168 230 677 2.35 2.30 3.95 2.91
• Es posible producir plantas completas y fértiles mediante cultivo in vitro de anteras utilizando plantas de uchuva de cultivos comerciales.
• Con los cruzamientos entre plantas obtenidas in vitro se obtuvo semilla F1 como base para la evaluación híbridos en uchuva utilizando líneas genéticamente puras.
• La identifi cación del número de cromosomas de las plan- tas de cultivos comerciales permite relacionarlas con los ecotipos conocidos y saber a cuál corresponde la uchuva cultivada.
• A diferencia de otras especies ampliamente estudiadas, la uchuva responde fácilmente y en corto tiempo a la produc- ción de embriones y plantas completas utilizando el cultivo de anteras.
La tecnología, por ofrecer un proceso de obtención de líneas genéticamente puras, puede acorta el ciclo de obtención de varie- dades e híbridos. Se recomienda que los protocolos descritos en esta publicación sean aplicados a materiales cultivados en otras regiones del país diferentes a las de Boyacá y Cundinamarca. Además, se recomienda que en el país se conforme un programa estructurado de mejoramiento genético como parte de un plan nacional integral de investigación.
Antera. La antera y el fi lamento juntos forman el estambre, la parte masculina de la fl or.
Haploide. Una célula u organismo que tienen un solo juego de cromosomas.
Doble haploide. Planta haploide que se le ha doblado su número de cromosomas.
Línea pura. Planta que su información genética es idéntica en cada par de cromosoma que posee.
Microspóras. Granos de polen en estado de desarrollo inmaduro.
In vitro. Literalmente signifi ca dentro del vidrio. Es el cultivo de células, de tejidos u órganos en contenedores en condiciones asépticas.
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